蛋白质组水平电泳体选择性分析新方法：揭示56种炔烃探针靶向九种氨基酸残基的化学蛋白质组学图谱

《Nature Chemistry》：Profiling the proteome-wide selectivity of diverse electrophiles

本研究针对共价抑制剂开发中氨基酸选择性评估的难题，开发了基于isoDTB-ABPP平台和MSFragger-FragPipe计算流程的无偏分析方法。研究人员系统比较了56种含炔烃反应基团的探针在金黄色葡萄球菌SH1000裂解液中的蛋白质组水平选择性，成功鉴定出17种可特异性靶向九种氨基酸残基和蛋白质N末端的优选探针，为共价抑制剂开发提供了重要的工具库和方法学支持。

　　

在药物研发领域，共价抑制剂因其与靶标蛋白的高亲和力和持久的药效学特性而备受关注。然而，这类抑制剂的发展长期面临一个关键瓶颈：大多数共价抑制剂主要靶向半胱氨酸残基，而半胱氨酸在蛋白质组中含量稀少，许多重要的药物靶点缺乏可用的半胱氨酸残基。虽然科研人员已经开发出一些针对其他氨基酸的共价修饰策略，但由于缺乏系统性的比较分析方法，不同反应基团在真实蛋白质组环境中的选择性和效率一直难以准确评估。

针对这一挑战，由Patrick R.A. Zanon和Stephan M. Hacker领导的研究团队在《Nature Chemistry》上发表了一项突破性研究。他们开发了一套全新的无偏分析流程，能够全面评估不同亲电试剂在蛋白质组水平的反应选择性。这项研究不仅提供了一种强大的分析方法，还系统比较了56种含炔烃反应基团的探针，最终鉴定出一组能够特异性监测九种不同氨基酸残基和蛋白质N末端的优选探针。

研究人员首先对基于MSFragger的FragPipe计算平台进行了优化，使其能够无偏地分析复杂蛋白质组数据。他们开发了开放搜索功能来识别未知修饰的质量，通过质量偏移搜索定位修饰位点，并扩展了IonQuant模块以实现同位素标记肽段的相对定量。这一改进的计算平台能够准确识别修饰质量、确定氨基酸选择性并进行定量分析，为后续的大规模探针比较奠定了基础。

研究团队建立标准化的样品制备流程，在金黄色葡萄球菌SH1000裂解液中系统测试了所有探针。每个探针实验都使用100μM浓度处理两个相同的样品，分别与轻链或重链isoDTB标签连接，以1:1比例混合后进行分析。这种标准化流程确保了不同探针之间的数据可比性。

半胱氨酸监测工具的验证与发现

研究确认碘乙酰胺炔烃(IA-alkyne)仍然是监测半胱氨酸的金标准，在100μM浓度下显示出95%的半胱氨酸选择性，定量了1,197个半胱氨酸位点。同时，研究人员还验证了多种其他半胱氨酸靶向探针，包括氯乙酰胺炔烃(CA-alkyne)、α-溴甲基酮炔烃(BMK-alkyne)、亲核芳香取代试剂(PFPSA-alkyne等)以及高价碘试剂(EBX2-alkyne)。值得注意的是，EBX2-alkyne能够选择性地引入最小修饰——乙炔基，显示出85%的半胱氨酸选择性，定量了1,251个半胱氨酸位点。

赖氨酸选择性探针的系统评估

研究团队验证了激活酯探针(STP-alkyne)对赖氨酸的高选择性(78%)，定量了3,277个赖氨酸位点。其他酰化试剂如TFP-alkyne、NHS-alkyne等也显示出类似的赖氨酸选择性。特别值得关注的是，方酸衍生物(AlkSq-alkyne和ArSq-alkyne)表现出极高的赖氨酸选择性(90-93%)，而基于2-乙炔基苯甲醛的探针(EBA-alkyne)和光激活的邻硝基苯甲醛探针(oNBA-alkyne)也显示出良好的赖氨酸选择性。

蛋白质N末端的特异性监测

虽然一些赖氨酸定向探针可以监测蛋白质N末端，但研究人员发现基于缺电子杂芳烃的羧醛探针(PCA-alkyne)在1mM浓度下对蛋白质N末端显示出93%的高选择性，定量了167个蛋白质N末端。结合其他探针的数据，研究共定量了464个蛋白质N末端，覆盖了金黄色葡萄球菌基因组中14%的编码蛋白质。

天冬氨酸和谷氨酸的全局分析

研究人员验证了之前开发的2,5-二取代四唑探针(PhTet-alkyne、AmTet-alkyne和MeTet-alkyne)对天冬氨酸和谷氨酸的选择性。特别是MeTet-alkyne显示出79-94%的羧酸选择性，定量了2,192个天冬氨酸和谷氨酸位点。此外，腙氯炔烃(HC-alkyne)也显示出优异的反应性和选择性(91%，2,450个羧酸位点)。值得注意的是，这些探针在谷氨酸和天冬氨酸之间显示出不同的偏好性，为特异性研究提供了更多选择。

酪氨酸特异性化学的拓展

研究评估了基于硫(VI)交换化学的探针(SuFEx-alkyne、SuTEx1-alkyne和SuTEx2-alkyne)以及基于三唑二酮的探针(PTAD-alkyne)。SuTEx2-alkyne显示出最高的酪氨酸选择性，定量了2,653个酪氨酸位点。特别值得注意的是，PTAD-alkyne显示出95%的酪氨酸选择性，虽然存在一定的副反应，但其卓越的选择性为优化互补探针的开发提供了基础。

甲硫氨酸监测工具的开发

基于之前描述的甲硫氨酸修饰设计原则，研究人员合成了OxMet2-alkyne，该探针显示出73%的甲硫氨酸选择性，定量了1,838个甲硫氨酸位点，覆盖了金黄色葡萄球菌基因组中8.5%的编码甲硫氨酸。这是首个能够在蛋白质组水平特异性监测甲硫氨酸的定制试剂。

色氨酸和组氨酸的同时监测

N-氨基甲酰吡啶鎓盐探针(CP-alkyne)在保护性气体下通过光诱导电子转移机制，显示出对色氨酸(55%)和组氨酸(35%)的选择性标记，定量了467个色氨酸和797个组氨酸位点。这是目前监测组氨酸的最佳探针选择。同时，研究人员还评估了紫外激活的邻醌甲基前体探针(HMN-alkyne、HMP-alkyne和MMP-alkyne)，这些探针主要靶向色氨酸，为色氨酸研究提供了互补工具。

精氨酸监测的新方法

基于苯乙二醛与精氨酸已知反应性的PhGO-alkyne探针在1mM浓度下显示出91%的精氨酸选择性，定量了1,544个精氨酸位点。这是首个能够在残基特异性蛋白质组学中全局监测精氨酸的方法。

通过系统筛选56种炔烃探针，研究团队最终确定了一组17种优选探针，能够特异性研究九种不同氨基酸残基和蛋白质N末端。这些探针共定量了20,558个不同的位点，覆盖了金黄色葡萄球菌基因组中47%的编码蛋白质和85%的注释必需蛋白质。为了验证这些探针在更广泛生物系统中的适用性，研究人员还在人癌细胞系MDA-MB-231裂解液中测试了这些探针，结果显示大多数探针在人类蛋白质组中保持了类似的选择性。

这项研究的成功不仅在于开发了一套强大的分析流程，更重要的是建立了一个全面的探针工具库，为共价抑制剂开发提供了重要的资源。研究人员强调，报道的选择性仅指那些能够在整个isoDTB-ABPP工作流程中保持稳定的修饰，某些探针可能会产生更多不稳定的修饰，这些在共价抑制剂设计中也需要考虑。

该研究的创新性在于首次实现了不同亲电试剂在蛋白质组水平选择性的直接比较，为共价药物开发提供了重要的方法论支持。通过这项研究，科研人员现在能够监测九种不同氨基酸残基和蛋白质N末端，极大地扩展了共价抑制剂设计的化学空间。这些工具和方法预计将在发现和设计靶向多样氨基酸的共价配体方面发挥重要作用，推动针对缺乏合适半胱氨酸残基的蛋白质结合位点的共价抑制剂开发。