利用DIA-MS实现原生消化与分子量筛选的集成技术：一种用于高通量蛋白质（HCP）定量分析的灵敏且高效的方法

《Talanta》：Integrated Native Digestion and Molecular Weight Cutoff Enrichment with DIA-MS: a Sensitive and Selective Approach for Quantitative Analysis of HCP

HCP检测灵敏度提升至0.5ppm，通过两阶段天然消化与MWCO过滤消除治疗蛋白干扰，实现抗体纯化过程实时监控与优化，验证方法符合生物分析规范。

　　

龚雅川|赵彦佳|彭瑞|齐文|张毅|彭颖|郑江

沈阳药科大学创新学院，中国辽宁省沈阳市110016

摘要

在生物制药生产过程中，残留的宿主细胞蛋白（HCPs）不仅会降低药物疗效，还会对患者安全和产品稳定性构成风险，尤其是当存在高风险HCPs时。因此，在下游纯化过程中持续监测HCPs的含量和种类至关重要。尽管基于液相色谱-质谱的蛋白质组学已成为识别HCPs的有效方法，但其应用受到高丰度治疗性蛋白与微量HCPs（浓度为百万分之一，ppm）之间动态范围差异的阻碍。在这里，我们开发了一种创新的工作流程，摒弃了传统的治疗性蛋白预分离步骤，以提高HCPs的检测能力。通过结合两阶段天然消化策略和分子量截留过滤技术，实现了高效的HCPs分离和富集。质谱数据采用数据独立采集模式获取，并使用Spectronaut软件进行处理以构建光谱库。这种集成方法能够检测到低至0.5 ppm的HCPs，并对关键杂质（如高风险蛋白G3I6T）进行连续定量跟踪，从而实现对抗体纯化过程的实时监测并支持工艺优化。与ELISA的比较研究表明，我们的方法具有更高的灵敏度和特异性，而系统的方法验证也证实了其符合生物分析要求，证明了所提出方法的稳健性。

章节摘录

引言

在治疗性生物制剂的生产过程中，宿主细胞会表达残留的宿主细胞蛋白（HCPs）。对于人体而言，这些源自宿主细胞的蛋白质是外来的，可能会引发免疫反应和其他副作用。¹ HCPs的存在会影响药物与目标蛋白的结合能力，从而影响药物的疗效。此外，某些具有酶活性的HCPs（如蛋白酶或二硫键还原酶）还可能降解治疗性蛋白。

材料与方法

试剂和化学品。 所有抗体均由杭州浩阳生物技术有限公司提供。抗体通过一系列纯化步骤进行纯化，包括亲和层析（AC）、病毒灭活（VIN）、中等深度过滤（IDF）、阴离子交换层析（AEX）、阳离子交换层析（CEX）和超滤/渗滤（UF/DF）。在每个纯化步骤后收集样品以进行进一步的质量控制分析。使用的层析柱为色谱级。

结果与讨论

基于质谱的蛋白质组学中数据依赖采集模式与数据独立采集模式的比较分析。 数据依赖采集（DDA）和数据独立采集（DIA）是两种主要的质谱数据采集模式，尤其在蛋白质组学研究和HCPs分析中广泛应用。这两种方法在检测策略、光谱覆盖范围和分析性能方面存在根本差异。¹² 为了确定最佳的质谱

结论

我们成功开发了一种用于灵敏检测治疗性抗体混合物中HCPs的新方法，通过优化的富集策略实现了低至0.5 ppm的可靠定量能力。该方法采用了两阶段天然消化过程与分子量截留过滤技术，有效去除了抗体中的药物成分，同时有效富集了微量HCPs。超滤参数的精细优化确保了抗体的最大去除效果。

CRediT作者贡献声明

张毅：项目管理、方法学设计、研究实施、资金筹集、数据分析、数据管理、概念构思。彭颖：撰写与审稿编辑、数据可视化、方法验证、项目监督、软件应用、资源协调、项目管理、方法学设计、研究实施、资金筹集、数据分析、数据管理、概念构思。郑江：撰写与审稿编辑、项目监督、资金筹集、概念构思。龚雅川：撰写与审稿编辑。

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。