基于脑脊液游离DNA多靶点实时PCR技术诊断结核性脑膜炎：一项170例病例的研究

《Tuberculosis》：Diagnosing Tuberculous meningitis from Cell-free DNA by multi-targeted real-time PCR: an experience from 170 cases.

本研究针对结核性脑膜炎(TBM)诊断难题，开发了基于脑脊液游离DNA(Cf-DNA)的多靶点实时PCR(M-rtPCR)检测方法。通过对170例TBM患者和100例非结核对照的样本分析，证实该方法灵敏度达78.24%，特异性100%，较GeneXpert Ultra和Truenat MTB Plus多检出14例病例。该研究为TBM的早期诊断提供了更灵敏可靠的分子检测方案。

　　

在全球结核病防治形势依然严峻的背景下，结核性脑膜炎(Tuberculous meningitis, TBM)作为最严重的肺外结核类型，其诊断一直是临床面临的重大挑战。根据2024年全球结核病报告，2023年全球新发结核病例达1080万例，其中印度贡献了最大份额。TBM不仅导致50%的死亡率，幸存者中还有半数会遗留神经系统后遗症。更令人担忧的是，印度报告了全球最多的TBM病例，而现有诊断方法在灵敏度和时效性方面仍存在明显不足。

传统的微生物学检测方法如抗酸染色灵敏度低，培养法耗时长达数周，难以满足临床快速诊断的需求。虽然核酸扩增检测(Nucleic acid amplification tests, NAATs)如GeneXpert MTB/RIF Ultra和Truenat MTB Plus已被推荐为肺外结核的一线检测方法，但它们在TBM诊断中的灵敏度分别为67.6%和78.7%，仍有提升空间。此外，这些商业化的检测平台还存在设备依赖性强、需要稳定电源供应等局限性。

在此背景下，研究人员将目光投向了细胞游离DNA(Cell-free DNA, Cf-DNA)检测这一新兴技术。Cf-DNA是指从死亡或凋亡细胞直接释放到体液中的DNA片段。虽然这一技术最初用于检测孕妇胎儿DNA或肿瘤患者循环DNA，但近年来已被拓展应用于结核分枝杆菌等病原体的检测。特别值得注意的是，此前仅有两项研究探索了Cf-DNA在TBM诊断中的应用，但灵敏度仅为56%和53%，且仅限于使用单一基因靶点IS6110。

为了突破这一瓶颈，研究人员开展了一项创新性研究，旨在评估基于Cf-DNA的多靶点实时PCR(Multitargeted real-time PCR, M-rtPCR)在TBM诊断中的价值。该研究通过同时检测IS6110、IS1081和nrdZ三个基因靶点，并对170例TBM患者和100例非结核对照的脑脊液样本进行系统分析，为TBM的精准诊断提供了新的解决方案。相关研究成果发表在《Tuberculosis》杂志上。

在研究方法上，研究团队采用了严谨的实验设计和先进的技术平台。他们从2010年4月至2025年3月期间收集了270例脑脊液样本，根据Marais标准将其分为明确TBM组(146例)、疑似TBM组(24例)和非结核对照组(100例)。关键技术方法包括：使用QIAamp循环核酸试剂盒从脑脊液上清液中提取Cf-DNA；建立同时检测IS6110、IS1081和nrdZ三个基因靶点的多重实时PCR体系；与GeneXpert MTB/RIF Ultra和Truenat MTB Plus两种商业化检测平台进行平行比较；通过rpoB基因测序验证利福平耐药性结果。

检测TBM的效能

研究结果显示，Cf-DNA M-rtPCR在诊断TBM(明确+疑似)时的总体灵敏度为78.24%，特异性为100%，阳性预测值和阴性预测值分别为100%和72.99%。这一性能显著优于GeneXpert Ultra(70%)和Truenat MTB Plus(68.82%)。特别值得注意的是，Cf-DNA M-rtPCR额外检测出了14例被其他两种分子检测方法漏诊的病例，其中2例属于明确TBM组，12例属于疑似TBM组。在诊断明确TBM时，Cf-DNA M-rtPCR的灵敏度达到82.88%，与另外两种方法的性能相当但略有优势。

各基因靶点的检测性能

对三个基因靶点的单独分析揭示了有趣的现象：IS1081检测到的TBM病例数最多(129/170)，其次是IS6110(123/170)和nrdZ(120/170)。特别重要的是，有8个病例仅被IS1081检测到，3个病例仅被IS6110检测到，1个病例仅被nrdZ检测到。这一结果凸显了多靶点检测策略的价值，因为单一靶点可能会漏检部分病例。三个靶点组合使用的检测灵敏度达到80.58%，显著提高了TBM的检出率。

利福平耐药性检测

在耐药性检测方面，Cf-DNA M-rtPCR检测到的133例TBM病例中，通过rpoB基因测序发现6例存在利福平耐药相关突变，主要位于531(4例)、526(1例)和516(1例)密码子。这6例利福平耐药病例也被GeneXpert Ultra和Truenat MTB Plus正确识别。然而，有48-49%的病例被报告为利福平药敏结果不确定，这些病例的细菌载量均处于痕量至低水平。

研究的讨论部分深入分析了Cf-DNA M-rtPCR性能优越的可能机制。与之前仅使用单一基因靶点IS6110的研究相比，本研究采用的三靶点策略显著提高了检测灵敏度。IS1081表现最优的可能原因是，在北印度结核分枝杆菌菌株中，IS6110存在缺失或仅为单拷贝的比例较高(10-40%)，而IS1081在不同菌株间的分布更为稳定。

尽管Cf-DNA M-rtPCR本身不提供利福平药敏检测功能，但结合rpoB基因测序后，不仅能诊断出更多TBM病例，还能对所有病例进行准确的利福平药敏判断。在检测时间方面，GeneXpert Ultra约需60分钟，Cf-DNA M-rtPCR约需90分钟，Truenat MTB Plus约需120分钟，显示出良好的临床应用前景。

这项研究的创新之处在于首次将多靶点检测策略应用于TBM的Cf-DNA诊断，并通过与两种商业化平台的系统比较，证实了该方法在灵敏度方面的优势。研究结果不仅为TBM的早期诊断提供了更可靠的工具，也为优化肺外结核的诊断策略提供了重要参考。特别是在高结核负担地区，这种高灵敏度、高特异性的检测方法有望显著改善TBM患者的预后，为结核病的消除目标贡献力量。

当然，研究也存在一些局限性，如仅使用脑脊液样本而未探索血液、尿液等更易获取的样本类型，未尝试超灵敏杂交或细胞外囊泡等DNA富集方法，以及使用冻存样本可能存在的DNA降解问题。这些方面为未来研究指明了方向。

总体而言，这项研究证实了基于脑脊液Cf-DNA的多靶点实时PCR是一种可靠、灵敏的TBM诊断方法，其优异的性能使其有望成为结核性脑膜炎诊断的重要补充工具，特别是在商业化分子检测平台表现受限的情况下，为临床医生提供了新的诊断选择。