基于生物信息学方法识别慢性阻塞性肺疾病（COPD）中与树突状细胞相关的基因

《International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease》：Identification of Dendritic Cell-Associated Genes in COPD Based on Bioinformatics

COPD患者肺组织中树突状细胞相关基因鉴定及功能验证研究通过整合scRNA-seq、RNA-seq和WGCNA分析，结合小鼠模型和实验验证，发现RASGRP3、C1QB、BLOC1S2和VSIG4四基因与COPD疾病表型显著相关，其中RASGRP3上调，其他三基因下调，并在肺组织炎症及细胞间通讯中起关键调控作用。

　　慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种严重的呼吸系统疾病，其特征是持续的气道炎症和肺组织损伤。随着研究的深入，科学家们逐渐认识到，这种疾病的发展与免疫系统的异常活动密切相关，尤其是树突状细胞（dendritic cells, DCs）在其中扮演了重要角色。树突状细胞作为免疫系统中的核心抗原呈递细胞，不仅能够捕获和处理抗原，还对免疫反应的启动和调节起着关键作用。因此，明确与树突状细胞相关的基因在COPD中的表达模式和功能意义，对于理解疾病机制以及开发新的免疫治疗方法具有重要意义。

本研究通过整合生物信息学分析和实验验证，旨在识别与COPD患者肺组织中树突状细胞相关的关键基因。研究采用了多种高通量测序技术，包括单细胞RNA测序（scRNA-seq）和RNA测序（RNA-seq），并结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）来探索基因表达模式与疾病表型之间的关系。通过分析不同数据集中的差异表达基因（DEGs），研究团队最终确定了四个与树突状细胞相关且可能参与COPD病理过程的基因：RASGRP3（上调）、C1QB、BLOC1S2和VSIG4（下调）。这些基因的表达变化不仅在COPD患者的肺组织中得到验证，也在由香烟烟雾诱导的肺气肿小鼠模型和香烟烟雾提取物（CSE）处理的骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）中被确认。

首先，研究团队使用GSE196638数据集的单细胞RNA测序数据，分析了经典树突状细胞（cDCs）在健康人和COPD患者肺组织中的基因表达差异。通过严格的质控筛选，研究人员保留了总基因数在300到5000之间的细胞，并排除了线粒体基因和红细胞基因表达比例过高的样本。随后，通过标准化表达矩阵、消除批次效应和使用Harmony算法进行整合，研究人员将样本划分为不同的细胞簇，并进一步通过功能注释和通路富集分析揭示了这些基因的生物学功能。研究发现，这些差异表达的基因主要与免疫反应、干扰素-γ反应、Th1和Th2细胞分化以及TNF和IL-17信号通路有关，表明树突状细胞在COPD的免疫调节中起着关键作用。

其次，研究团队利用GSE26296数据集的RNA测序数据，分析了肺气肿患者肺组织中髓样树突状细胞（mDCs）的差异表达基因。通过使用limma软件包进行差异表达分析，研究人员确定了656个显著差异表达的基因，其中332个上调，324个下调。这些基因主要涉及脂肪酸代谢、免疫反应激活、细胞脂质分解代谢以及对干扰素-γ的反应。此外，KEGG分析显示，上调基因与抗凝血反应、TNF信号通路和IL-17信号通路有关，而下调基因则与补体和凝血级联反应、NOD样受体信号通路相关。这些结果进一步支持了树突状细胞在COPD病理过程中可能发挥的重要作用。

为了更全面地理解这些基因与COPD之间的关联，研究团队还对GSE38974数据集进行了WGCNA分析，以识别与COPD表型相关性最高的基因模块。通过构建无偏倚的共表达网络，研究人员发现绿色-黄色模块和红色模块与COPD具有显著的相关性。进一步分析表明，这些模块中的基因可能在疾病的发展过程中发挥关键作用。同时，通过将GSE38974数据集中的基因模块与差异表达基因进行交叉分析，研究团队确定了四个可能与COPD相关的树突状细胞基因：RASGRP3、C1QB、BLOC1S2和VSIG4。这些基因的表达趋势在实验模型中得到了验证，其中RT-qPCR和Western blot结果显示，在CSE处理的BMDCs和香烟烟雾诱导的肺气肿小鼠肺组织中，这些基因的表达模式与生物信息学分析结果一致。

实验验证部分，研究人员构建了香烟烟雾诱导的肺气肿小鼠模型，并对肺组织进行了组织学分析。结果显示，暴露于香烟烟雾的小鼠肺部出现了肺泡扩张和更高的平均线性截距（MLI），表明肺组织损伤程度增加。进一步的RT-qPCR分析显示，RASGRP3在香烟烟雾暴露小鼠的肺组织中表达上调，而C1QB、BLOC1S2和VSIG4表达下调。此外，Western blot实验确认了VSIG4蛋白在肺气肿小鼠肺组织中的表达水平显著降低。这些结果不仅验证了生物信息学分析的可靠性，还为这些基因在COPD中的潜在作用提供了实验依据。

从生物学功能的角度来看，RASGRP3在树突状细胞中表达上调，可能与COPD的炎症反应和免疫调节有关。RASGRP3是Ras-MAPK信号通路中的关键调节因子，能够影响细胞生长、分化和免疫反应。在T细胞成熟初期，RASGRP3对T细胞的发育和激活具有重要作用，同时还能通过增强B细胞受体信号促进B细胞的增殖。因此，RASGRP3的上调可能与树突状细胞在COPD中的异常激活有关，进而影响其抗原呈递能力，促进炎症反应的持续发展。

C1QB和BLOC1S2的下调可能对COPD的进展产生负面影响。C1QB是经典补体途径中的关键组分，参与免疫调节和炎症反应。研究表明，香烟烟雾刺激会导致C1q水平下降，从而促进肺气肿的发展。在COPD患者肺组织中，C1QB的表达水平显著降低，可能与Th17细胞的增加有关，进而加剧肺部炎症。BLOC1S2则与溶酶体的生物合成和运输密切相关。在COPD患者的肺组织中，溶酶体功能异常可能导致自噬紊乱，进而影响细胞的正常代谢和免疫反应。此外，BLOC1S2还参与肝脏星状细胞的生长和成熟，以及造血干细胞的分化过程。在COPD患者中，BLOC1S2的表达下降可能与免疫细胞的异常功能和疾病进展有关。

VSIG4的下调则可能削弱其免疫调节作用，从而促进COPD的炎症反应。VSIG4是一种B7家族的免疫检查点受体，主要表达于髓样树突状细胞和巨噬细胞表面，能够抑制T细胞的增殖以及IL-2和IFN-γ的分泌。在COPD患者的肺组织中，VSIG4的表达水平显著降低，这可能削弱其抗炎功能，导致免疫反应的失控。实验结果表明，VSIG4的表达下降可能促进CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的激活和增殖，从而加剧肺部炎症。Western blot分析进一步证实了这一现象，表明VSIG4蛋白在香烟烟雾暴露小鼠肺组织中的表达水平明显低于对照组。

通过整合生物信息学分析和实验验证，本研究不仅揭示了与COPD相关的树突状细胞基因，还探讨了这些基因在疾病发生和发展中的潜在作用。这些发现为理解COPD的免疫机制提供了新的视角，同时也为开发以树突状细胞为靶点的免疫治疗方法提供了理论依据。然而，研究仍存在一些局限性，例如缺乏临床样本以进一步验证这些基因在疾病发生中的具体作用机制，以及与其他免疫细胞的相互作用仍需深入探索。未来的研究可以结合更多临床数据和实验模型，进一步阐明这些基因在COPD中的具体功能和调控机制，为精准医疗和免疫治疗提供更加坚实的科学基础。