优化线粒体ATP产量检测方法：96孔板高灵敏度检测技术的建立与临床应用

《Analytical Biochemistry》：Advancing a sensitive method for measuring mitochondrial ATP production in small muscle biopsy samples

本研究针对线粒体疾病诊断中肌肉活检样本量少、检测效率低的问题，开发了一种优化的96孔板发光法检测线粒体ATP产量(MAPR)。该方法仅需10 μL线粒体样本即可在15分钟内完成12种底物组合的检测，测量范围0.3-70 nmol/min/L，并建立了涵盖7个月至79岁人群的参考数据集。该技术为线粒体功能障碍的临床诊断和研究提供了高效可靠的检测平台。

　　

在医学诊断领域，线粒体疾病一直以其复杂性和诊断难度著称。这类疾病影响细胞能量工厂——线粒体的正常功能，导致机体能量供应不足。尽管基因测序技术日益先进，但仍有约四分之一的疑似患者需要通过肌肉活检进行生化检测才能确诊。传统的线粒体功能检测方法存在样本需求量大、检测效率低等局限性，这促使研究人员不断寻求更优化的检测方案。

瑞典卡罗林斯卡大学医院遗传代谢病中心的科研团队在《Analytical Biochemistry》上发表了一项重要研究，他们成功开发了一种改进的线粒体ATP产量(MAPR)检测方法。这项技术的创新之处在于将其适配到96孔微孔板格式，大大提高了检测通量和效率。

为了开展这项研究，研究人员建立了145名疑似线粒体疾病患者的队列，最终确定92名非线粒体疾病患者作为参考人群。关键技术方法包括：优化的线粒体分离技术、96孔板发光法MAPR检测体系、多种底物组合测试方案以及自动化OXPHOS酶活性分析系统。这些方法的结合使得检测灵敏度显著提高，仅需10 μL线粒体样本就能完成全面检测。

3.1. 96孔微孔板MAPR方法的适配

研究人员通过精密仪器评估和条件优化，成功将MAPR方法适配到96孔板格式。他们发现ATP校准器的添加变异系数小于2%，测量线性度达到r2=0.999。特别值得注意的是，他们对酰基肉碱系列底物进行了浓度滴定，确定了C10-C18的最佳使用浓度。更重要的是，他们发现丙酮酸+苹果酸(P+M)底物组合在pH 6.7时活性最佳，这为后续检测条件优化提供了重要依据。

3.2. MAPR方法的验证

方法验证结果显示，线性测量范围达到70 nmol/min/L，功能灵敏度为0.3 nmol/min/L。精密度分析表明，总变异系数为5.8%。样本稳定性测试显示，线粒体样本在冰上保存30分钟内活性损失小于10%。特异性实验证实，钠叠氮化物和寡霉素能完全抑制所有底物的ATP产量，验证了方法的特异性。

3.3. 人肌肉MAPR参考值

研究建立了涵盖7个月至79岁人群的MAPR参考值。结果显示，以G+S为底物的最大MAPR在新生儿期较低，到10岁时约增加一倍，成年期保持相对稳定，60岁后略有下降。有趣的是，脂肪酸底物支持的MAPR在整个生命周期中保持稳定，这表明儿童期脂肪利用能力相对较强。

3.4. 三名患者的实验室研究

研究还展示了三名携带不同致病基因变异患者的检测结果。患者A携带PDHA1基因变异，表现为P+M底物特异性降低；患者B携带MT-TL1变异，显示复合物I和IV活性降低；患者C携带MT-ATP6变异，表现为复合物V活性下降。这些案例证明了MAPR方法在鉴别不同类型线粒体疾病中的临床应用价值。

在讨论部分，研究人员深入分析了方法学上的重要考量。他们指出，内部校准法是确保检测准确性的关键，而ADP纯度对降低背景ATP水平至关重要。特别值得关注的是，他们发现丙酮酸代谢在酸性条件下(pH 6.6-6.9)活性增强的现象，这可能是肌肉在剧烈运动时优先利用碳水化合物的一种适应性机制。

这项研究的临床意义在于，它将线粒体功能检测的时间从传统方法的数小时缩短到1小时内完成，且样本需求量显著减少。建立的年龄特异性参考值为不同年龄段患者的诊断提供了更精确的依据。该方法不仅适用于临床诊断，还能用于基础研究，如研究不同生理状态下线粒体能量代谢的特点。

研究人员强调，尽管基因诊断技术不断发展，但功能性检测如MAPR在诊断未知变异或复杂病例中仍具有不可替代的价值。该方法的高通量特性使其特别适合用于大规模筛查和研究项目，为线粒体疾病的精准诊断和治疗监测提供了有力工具。

这项技术的推广应用将有助于提高线粒体疾病的诊断效率，特别是在儿科患者中，早期诊断可以及时引导治疗决策，改善患者预后。同时，建立的标准操作流程和质控体系为其他实验室建立类似方法提供了重要参考。