灰葡萄孢菌丝体农杆菌介导遗传转化技术的优化与应用

《Canadian Journal of Microbiology》：Simplified and efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation of Botrytis cinerea using mycelia

本研究针对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）传统遗传转化方法（依赖分生孢子或原生质体）存在效率低、操作繁琐、结果不稳定等问题，开发了一种基于菌丝体的农杆菌介导转化（AMT）新方法。该方法利用新构建的pFLexpress双元表达载体，成功实现了四种不同灰葡萄孢菌株的稳定转化，并通过qPCR和共聚焦显微镜证实了绿色荧光蛋白（GFP）的稳健表达。该技术简化了操作流程，提高了转化效率和可重复性，为灰葡萄孢的基因功能研究和植物病理学应用提供了高效、可靠的平台。

　　

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一种臭名昭著的死体营养型植物病原真菌，它引起的灰霉病给全球多种农作物带来巨大的经济损失。要深入理解其致病机制并开发有效的防控策略，离不开高效的遗传操作技术。然而，长期以来，对灰葡萄孢进行基因改造并非易事。传统的转化方法主要依赖于分生孢子或原生质体。前者需要真菌产生孢子，这个过程不仅耗时数周，而且孢子产量和活力因菌株而异，极不稳定；后者则需要用酶消化坚固的真菌细胞壁来制备原生质体，这个过程既费力又低效，且原生质体非常脆弱，再生率很低。这些技术瓶颈严重阻碍了灰葡萄孢的基因功能研究。

为了突破这些限制，研究人员将目光投向了农杆菌介导转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, AMT）技术。这项在植物中广泛应用的技术，因其能实现稳定的DNA整合和相对较高的效率，在真菌转化中也展现出巨大潜力。但遗憾的是，即便应用AMT，大多数研究仍以孢子为起始材料，未能从根本上摆脱对孢子生产的依赖。有没有一种更简单、更普适的转化材料呢？答案是肯定的——菌丝体。菌丝体是真菌营养生长的活跃阶段，可以持续获得，无需等待孢子形成，且更易于操作。尽管菌丝体AMT在其他真菌中已有报道，但在灰葡萄孢中仍缺乏一个成熟、可靠且被广泛应用的方案。

为此，研究人员开展了一项研究，旨在开发并验证一种基于菌丝体的、简化且高效的灰葡萄孢农杆菌介导遗传转化方法。这项研究成功发表于《Canadian Journal of Microbiology》上。

为开展此项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：首先，构建了新型双元表达载体pFLexpress，该载体包含绿色荧光蛋白（GFP）报告基因和潮霉素抗性筛选标记；其次，优化了以灰葡萄孢菌丝体为材料的农杆菌共培养转化流程；最后，利用实时定量PCR（qPCR）和激光扫描共聚焦显微镜等技术对转化子进行分子和蛋白水平的验证。研究所用的四种灰葡萄孢菌株均来自加拿大农业与农业食品部。

分子确认转化

研究人员通过实时定量PCR（qPCR）检测了四种不同灰葡萄孢菌株转化子中gfp基因的表达水平。结果显示，所有转化子均表现出强劲的gfp表达，其表达量相对于未转化的野生型菌株提高了20至70倍。尽管不同转化子间的表达量存在微小差异，但不同菌株之间的表达水平没有显著性差异。这表明该转化方法能在不同遗传背景的灰葡萄孢中实现一致且高效的转基因表达。

真菌细胞中GFP的可视化

为了在蛋白水平上确认转化成功，研究人员使用共聚焦显微镜观察了转化菌株的菌丝。图像清晰显示，在所有转化子中，明亮的绿色荧光信号遍布菌丝的细胞质和丝状结构，而未转化的野生型菌株则完全检测不到荧光。这直观地证实了gfp基因不仅成功整合到真菌基因组中，而且能够稳定地转录和翻译成有功能的GFP蛋白。

转化子的表型评估

研究人员比较了转化菌株与野生型菌株在非选择性培养基上的生长和形态。他们发现，所有四种遗传背景的转化菌株，其菌落形态均表现出一定程度的变化，例如菌落更为分散、不规则，并且径向生长速率普遍低于其对应的野生型菌株。在菌株3和菌株4中，这种生长减缓达到了统计学上的显著水平。研究人员分析认为，这种表型变化可能并非由gfp基因的表达直接引起，而更可能与T-DNA整合过程中的插入突变或载体骨架上的某些调控元件对宿主基因表达的影响有关。重要的是，尽管存在这些形态学上的改变，转化子依然保持活力，并能稳定表达转基因，证明了该转化方法的可靠性。

综上所述，本研究成功建立了一种基于菌丝体的灰葡萄孢农杆菌介导转化方法。该方法彻底摆脱了对孢子或原生质体的依赖，操作流程显著简化，并在四种不同遗传背景的菌株中实现了100%的转化成功率，展现出优异的可重复性和普适性。通过qPCR和共聚焦显微镜分析，证实了转基因能够稳定整合并高效表达。虽然转化子表现出一些可预见的表型变化，但这并不影响该方法在基因功能研究中的核心价值。

这项研究的成功，为灰葡萄孢乃至其他难以转化丝状真菌的遗传操作提供了一个强大、实用且可扩展的新工具。它极大地降低了遗传转化的技术门槛和时间成本，将有力推动真菌功能基因组学、病原菌与寄主互作机制以及新型病害防控策略的开发等研究领域的进展。这项技术有望成为植物病理学和真菌生物学研究者的标准操作之一，为保障全球粮食安全贡献一份力量。