水解的Debaryomyces hansenii酵母作为鱼类的副益生菌：基于组学技术对大西洋鲑鱼在海水中自然病原体暴发期间的肠道特征进行分析

《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》：Hydrolyzed Debaryomyces hansenii yeasts as paraprobiotics in fish: Omics-based characterization of Atlantic salmon gut during a natural pathogen outbreak in seawater stage

研究两种水解酵母（LAN4和LAN6）对三文鱼肠道微生物组及蛋白组的影响，结合16S rRNA测序和代谢组学分析，发现LAN4增强免疫应答（如氨基酸代谢、氧化应激反应），而LAN6与炎症相关（如铁死亡、花生四烯酸代谢）。两处理均降低致病菌相关菌群丰度，验证D. hansenii作为副益生菌的潜力，为应对水产养殖中的病原挑战提供新策略。

　　在现代水产养殖业中，鱼类健康与生产性能的提升是行业持续关注的核心议题。随着全球对可持续食品生产需求的增加，尤其是对高价值鱼类如大西洋鲑鱼（*Salmo salar*）的养殖规模不断扩大，寻找能够改善鱼类生理功能、增强免疫系统以及促进肠道微生物群落稳定性的饲料添加剂成为研究重点。其中，一些具有生物活性的微生物成分，如酵母及其衍生的代谢产物，因其潜在的益生菌特性而受到重视。近年来，*Debaryomyces hansenii* 这种非*Saccharomyces*酵母因其在不同来源（如乳制品、海水和土壤）中被发现的免疫调节特性，被认为是一种有潜力的饲料添加剂，特别是在提升水产养殖物种的肠道微生物结构和生理功能方面。本研究旨在探讨两种来自不同*Debaryomyces hansenii*菌株的水解产物（LAN4 和 LAN6）对大西洋鲑鱼肠道微生物群落和蛋白质组的影响，并评估其在应对自然发生的细菌感染（如*Moritella viscosa*）时的作用。

### 1. 研究背景与意义

大西洋鲑鱼作为全球重要的水产养殖物种，其养殖产量和经济价值均占据重要地位。然而，水产养殖过程中常常面临多重压力，包括环境变化、营养不均衡、疾病感染等，这些因素对鱼类健康构成威胁，同时也影响到整个产业的可持续发展。为了解决这些问题，研究人员不断探索功能性饲料添加剂的应用，这些添加剂包括益生菌、益生元、外源酶等，它们可以通过改善肠道环境、增强免疫反应和提高营养吸收效率来提升鱼类的健康水平和生产性能。

酵母作为一种天然的微生物来源，其细胞壁中含有多种与宿主免疫系统相互作用的分子模式（MAMPs），如葡聚糖和甘露聚糖等。这些成分能够激活宿主的模式识别受体（PRRs），进而影响信号传导通路、转录因子以及细胞因子的表达，从而调节免疫反应。一些研究已经表明，*Debaryomyces hansenii* 在多种鱼类中表现出增强免疫应答和调节肠道微生物结构的能力，因此，将其用作饲料添加剂具有重要的应用前景。

此外，肠道不仅是营养吸收的主要场所，同时也是宿主免疫系统的重要组成部分。它参与局部和全身免疫反应的协调，并且是宿主与微生物之间互动的关键部位。因此，改善肠道微生物结构和功能对于提高鱼类的抗病能力具有重要意义。本研究中的实验设计旨在通过多组学方法（如16S rRNA基因测序和宏蛋白质组学）来深入分析两种水解酵母产品对大西洋鲑鱼肠道微生物群落和蛋白质组的影响，尤其是在面对自然发生的细菌感染时的表现。

### 2. 实验设计与方法

本研究采用了一种活体实验设计，以评估两种水解酵母产品（LAN4 和 LAN6）对大西洋鲑鱼肠道微生物和蛋白质组的影响。实验共使用了540条大西洋鲑鱼幼苗，这些鱼在初始阶段被接种了多种疫苗（包括针对*Aeromonas salmonicida*、*Vibrio anguillarum*、*Aliivibrio salmonicida*、*M. viscosa* 和传染性胰脏坏死病毒的抗原），以模拟实际养殖条件下的免疫挑战。随后，这些鱼被随机分配到九个300升的淡水循环水箱中，进行为期七周的淡水适应阶段。之后，每组鱼被转移到海水环境中，以模拟大西洋鲑鱼在养殖过程中经历的海水转移环节。海水阶段持续六周，并且在此期间，实验意外遭遇了*M. viscosa* 的自然爆发，这使得实验提前终止。

在实验过程中，所有鱼均被喂食三种不同的饲料：一种以鱼粉为主的商业饲料（Control diet, Ctr），以及两种分别添加了0.1% LAN4 和 LAN6 的实验饲料。所有饲料均通过挤压工艺和随后的真空涂油处理制作完成。为了确保实验数据的可靠性，所有样本在采集后立即冷冻保存，并在后续的分析中进行处理。实验过程中，研究人员使用了多种先进的技术手段，包括16S rRNA基因测序和宏蛋白质组学，以全面评估肠道微生物群落和蛋白质组的变化。

在16S rRNA基因测序部分，研究人员从大西洋鲑鱼的肠道内容物中提取DNA，并使用特定的引物对16S rRNA基因的V4可变区域进行扩增。扩增后的DNA序列通过DADA2算法进行去噪和拼接，最终生成了1170个扩增子序列变异体（ASVs），涵盖了52个不同的细菌属。这些数据被用于分析微生物群落的多样性（Alpha多样性）和差异性（Beta多样性），并结合主成分分析（PCA）和相关性分析，以进一步理解不同饲料对肠道微生物结构的影响。

在宏蛋白质组学分析中，研究人员从不同饲料组的鱼肠道内容物中提取蛋白质，并通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）进行鉴定和定量。这些蛋白质数据被用于功能富集分析，结合KEGG和GO数据库，以评估不同饲料对宿主蛋白质功能的影响。研究还涉及对某些关键蛋白的表达水平变化进行分析，以揭示酵母添加剂如何调节宿主的免疫反应和代谢过程。

### 3. 实验结果与分析

实验结果表明，两种酵母添加剂（LAN4 和 LAN6）对大西洋鲑鱼的肠道微生物群落和蛋白质组产生了不同的影响。首先，在微生物群落方面，LAN4和LAN6均显著改变了肠道中某些细菌属的相对丰度。例如，LAN4组的鱼肠道中出现了更多的*Bifidobacterium*、*Leucobacter*、*Caulobacter*、*Clostridium*、*Tissierella*、*Kurthia* 和*Exiguobacterium*，而LAN6组则增加了*Paenibacillus*、*Brevibacillus* 和*Rhodoglobus*。这些变化表明，两种酵母添加剂可能通过不同的机制影响肠道微生物群落的组成。

在蛋白质组方面，LAN4组的鱼表现出与氨基酸代谢、氧化应激反应和免疫稳态相关的蛋白质表达水平升高。这些蛋白质包括与氨基酸合成和代谢相关的多个功能术语，如丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸和半胱氨酸的代谢相关蛋白。此外，LAN4组还显示出更高的抗氧化反应相关蛋白表达，这可能有助于鱼类在面对自然细菌感染时维持免疫系统的稳定性。

相比之下，LAN6组的鱼则表现出与炎症反应相关的蛋白质表达增加，如铁死亡（ferroptosis）、花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）和细胞突起组装（regulation of cell projection assembly）等。这些结果表明，LAN6可能在促进炎症反应方面具有一定的作用，但这种作用是否有利于鱼类在面对病原体时的生存，仍需进一步研究。

此外，研究还发现，LAN4和LAN6在调节肠道微生物群落和蛋白质组方面存在显著差异。例如，LAN4组的鱼在面对*M. viscosa*感染时表现出更强的免疫应答，而LAN6组的鱼则可能因炎症反应的增强而面临更大的健康风险。这些差异可能与两种酵母来源的不同有关，例如LAN4来源于海水，而LAN6来源于乳制品，其细胞壁的组成和物理特性可能对宿主的免疫反应产生不同的影响。

### 4. 讨论与意义

本研究的结果揭示了两种*Debaryomyces hansenii*水解产物在调节大西洋鲑鱼肠道微生物群落和蛋白质组方面的不同作用。LAN4组的鱼表现出更强的免疫稳态和抗氧化能力，这可能与其来源和组成有关。相比之下，LAN6组的鱼则表现出更多的炎症相关蛋白表达，这可能意味着其在某些情况下可能对宿主免疫系统产生不利影响。

从实际应用角度来看，这两种酵母添加剂可以作为功能性饲料中的潜在成分，以改善鱼类的健康状况和生产性能。然而，由于实验中出现了自然细菌感染，研究人员无法得出关于饲料与疾病发展的直接关联。因此，未来的研究需要进一步探讨不同酵母添加剂在预防和缓解病原体感染方面的具体作用机制。

此外，研究还强调了肠道微生物群落和宿主免疫系统之间的复杂关系。肠道中的微生物不仅影响营养吸收，还通过代谢产物和细胞因子的分泌参与免疫调节。因此，通过调节肠道微生物群落，可以间接影响宿主的免疫功能和健康状况。这为未来开发基于肠道微生物调节的饲料添加剂提供了新的思路。

### 5. 结论

本研究通过多组学方法揭示了两种*Debaryomyces hansenii*水解产物（LAN4 和 LAN6）对大西洋鲑鱼肠道微生物群落和蛋白质组的不同影响。这些结果表明，这两种酵母添加剂可能在改善鱼类健康和增强免疫系统方面具有不同的潜力。其中，LAN4表现出更强的免疫稳态和抗氧化能力，而LAN6则可能促进炎症反应。这些发现为功能性饲料添加剂的研发提供了重要的参考，同时也为水产养殖业在应对疾病挑战时提供了新的解决方案。

此外，研究还强调了酵母添加剂在调节肠道微生物群落和宿主免疫反应方面的复杂性。未来的研究可以进一步探讨这些添加剂在不同养殖条件下的表现，并结合更多的实际数据，以评估其在促进鱼类健康和提高生产性能方面的长期效果。同时，随着对肠道微生物与宿主免疫系统之间相互作用的深入理解，新的饲料添加剂可能会被开发出来，以更有效地支持水产养殖业的可持续发展。