基于多溶剂提取和分子网络技术的咖啡废弃物代谢物谱分析及其资源化利用研究

《Computational and Structural Biotechnology Journal》：Multisolvent Metabolite Profiling of Coffee Waste by UHPLC-HRMS/MS and Molecular Networking

本研究针对咖啡加工废弃物（缺陷绿咖啡豆GB和废咖啡渣SCG）资源化利用不足的问题，通过五种不同极性溶剂（乙醇、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、己烷）系统提取Arabica和Robusta品种的GB与SCG中的代谢物。采用UHPLC-HRMS/MS、GC-MS和分子网络（MN）技术进行综合分析，结合主坐标分析（PCoA）和随机森林（RF）模型，揭示了溶剂极性和原料类型对代谢物多样性及功能潜力的显著影响。研究发现极性溶剂（如乙醇）更易提取亲水性抗氧化剂（如绿原酸），而非极性溶剂则倾向于回收脂肪酸和甾醇（尤其在SCG中）。该研究为咖啡副产物的高值化转化（如营养保健品和化妆品开发）提供了系统的化学图谱和筛选框架，具有重要的环境和经济意义。

　　

咖啡，作为全球最受欢迎的饮品之一，其生产和消费过程产生了大量副产物和废弃物，包括在农场分选过程中产生的缺陷绿咖啡豆（Green Bean, GB）以及在咖啡馆和工业环境中冲泡后产生的废咖啡渣（Spent Coffee Grounds, SCG）。据统计，全球每年产生的咖啡废弃物超过1000万吨，其中约一半被不当处置，导致环境污染和温室气体（如甲烷和CO₂）排放。值得注意的是，每吨新鲜采收的咖啡豆中约可得到50公斤缺陷GB，而每100公斤烘焙咖啡在加工过程中会产生45-50公斤SCG。面对这一严峻挑战，开发咖啡废弃物的可持续利用方案，以减轻环境压力并创造经济价值，显得尤为重要。

幸运的是，SCG和GB并非一无是处，它们富含多种生物活性化合物，如咖啡因、绿原酸（Chlorogenic Acid）和各类抗氧化剂，在食品、化妆品和制药行业具有广阔的应用前景。然而，这些生物活性化合物的含量和种类受到原料类型（如Arabica与Robusta品种）、加工方式（如烘焙程度）以及提取方法（如溶剂极性）的显著影响。传统的提取和分析方法往往局限于单一溶剂或特定类别的化合物，难以全面揭示咖啡废弃物复杂的化学多样性。因此，迫切需要一种能够系统、高效地解析咖啡废弃物中代谢物组成，并阐明其与提取条件、原料特性之间关系的新策略。

为了应对这一挑战，研究人员在《Computational and Structural Biotechnology Journal》上发表了一项题为“Multisolvent Metabolite Profiling of Coffee Waste by UHPLC-HRMS/MS and Molecular Networking”的研究。该研究由Surachet Soontontaweesub、Rungvigrai Lertsuwan、Thapanee Pruksatrakul、Atchara Paemaee、Verawat Champreda和Navadol Laosiripojana合作完成。他们旨在通过结合多种现代分析技术，深入探索咖啡废弃物作为功能性成分来源的潜力。

为了系统回答上述问题，研究人员开展了一项综合性研究。他们选取了四种咖啡废弃物原料：Arabica绿咖啡豆（GBA）、Robusta绿咖啡豆（GBR）、混合绿咖啡豆（GBM, Arabica:Robusta = 70:30）以及由GBM制备的SCG。研究采用了五种极性不同的溶剂（乙醇、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、己烷）进行索氏提取。对提取物进行了提取率计算、咖啡因和绿原酸的高效液相色谱（HPLC-DAD）定量、抗氧化活性（DPPH和ABTS法）评估。最关键的是，利用超高效液相色谱-高分辨串联质谱（UHPLC-HRMS/MS）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行了非靶向代谢物分析。获得的质谱数据进一步通过分子网络（Molecular Networking, MN）进行分析，该技术能够根据质谱碎裂相似性将结构相关的代谢物可视化聚类。此外，研究还运用了多变量统计方法，包括基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（Principal Coordinate Analysis, PCoA）进行无监督的模式识别，以及随机森林（Random Forest, RF）模型进行监督式分类和特征重要性评估，从而全面揭示溶剂和原料对代谢物谱的影响。

主要研究结果

3.1. 咖啡废弃物代谢物的提取

提取率受溶剂类型和原料性质的显著影响。总体而言，SCG在所有溶剂中的提取率最高，其中乙醇提取的SCG得率最高（21.77%）。GB的提取率相对较低，尤其在己烷等非极性溶剂中（GBA为4.8%）。乙醇作为极性溶剂，对所有咖啡原料均表现出较高的提取效率，这与其能溶解广泛的亲水和半极性生物活性化合物有关。而非极性溶剂（如己烷）则倾向于回收脂溶性成分，尤其在SCG中得率较高（15.06%），反映了SCG富含油脂和脂肪酸的特性。研究还指出，烘焙和冲泡过程改变了SCG的基质结构（如增加孔隙度），从而影响了溶剂的渗透和代谢物的可及性。

3.2. 活性化合物的定量分析

咖啡因和绿原酸的含量因原料和溶剂而异。GBM的咖啡因含量较高，尤其在二甲苯提取物中。与通常认知不同，本研究中GBR的咖啡因含量相对较低，可能源于商业批次间的差异。SCG的咖啡因含量在所有溶剂中均显著较低，这与冲泡过程中的溶出以及烘焙引起的基质变化有关。绿原酸则主要在极性溶剂（如乙醇）中从GB（尤其是GBR和GBM）中被高效提取，非极性溶剂和SCG中含量极低，印证了其亲水性本质。结果表明，优化生物活性化合物的回收需同时考虑溶剂极性和原料的物理化学属性。

3.3. 咖啡粗提物的抗氧化特性

抗氧化活性通过DPPH和ABTS自由基清除实验评估，结果以IC₅₀值表示（值越低活性越强）。乙醇提取物在所有咖啡原料中均表现出最强的抗氧化活性。 among the materials, GBM乙醇提取物的抗氧化活性最强（DPPH IC₅₀ = 81.7 ± 1.0 μg/mL, ABTS IC₅₀ = 71.0 ± 4.5 μg/mL），GBR次之，GBA相对较弱。SCG的抗氧化活性最弱，其乙醇提取物的IC₅₀值显著高于GB（DPPH: 892.1 ± 65.4 μg/mL）。这反映了SCG在烘焙和冲泡过程中亲水性抗氧化剂（如绿原酸）的损失。溶剂极性对抗氧化活性有决定性影响，乙醇优于乙酸乙酯和己烷等非极性溶剂。

3.4. 通过质谱法进行咖啡粗提物的代谢物分析

3.4.1. UHPLC-HRMS/MS分析

PCoA分析显示，无论是基于溶剂还是原料，代谢物谱在负离子模式下均呈现更清晰的分离。PERMANOVA分析表明，溶剂和原料类型分别解释了约26%和26-29%的代谢物谱变异。SCG的代谢物谱与所有GB类型明显分开，凸显了烘焙和冲泡引起的成分变化。RF模型进一步证实了这种分类的稳健性，对原料的分类准确率达到100%，对溶剂的分类准确率超过95%。代谢物注释显示，负离子模式更利于检测酚酸（如绿原酸及其异构体）和有机酸，而正离子模式则对生物碱（如咖啡因、葫芦巴碱）、脂质（如咖啡醇）和含氮化合物更敏感。热图分析和分子网络可视化清晰地展示了溶剂极性和原料类型对代谢物分布的影响：极性溶剂（乙醇、乙酸乙酯）富集了亲水性化合物，而非极性溶剂（己烷、甲苯、二甲苯）则与脂溶性成分（尤其在SCG中）密切相关。

3.4.2. GC-MS分析

GC-MS分子网络揭示了咖啡提取物中丰富的脂溶性代谢物。非极性溶剂（如己烷、甲苯）主要提取脂肪酸（如棕榈酸、亚油酸）和甾醇，这些成分在SCG提取物中尤为突出。半极性溶剂（如乙酸乙酯、乙醇）则能提取更广泛的化合物，包括挥发性酯类和极性有机酸（如奎尼酸）。分子网络成功地将结构相似的化合物（如异构体）聚类，提供了比常规色谱分析更丰富的结构关系信息。与以往主要使用单一极性溶剂的研究相比，本研究的多溶剂策略更全面地覆盖了咖啡副产物中的化学多样性，特别是脂溶性成分。

结论与意义

本研究通过整合多溶剂提取、UHPLC-HRMS/MS、GC-MS、分子网络（MN）以及多变量统计和机器学习（随机森林）分析，系统描绘了咖啡废弃物（GB和SCG）的代谢物图谱。研究结果表明，提取溶剂的选择和原料的来源共同决定了代谢物的回收谱和功能潜力。极性溶剂（如乙醇）更适合从GB中提取具有抗氧化活性的亲水性化合物（如绿原酸），而非极性溶剂（如己烷）则能有效回收SCG中富含的脂溶性成分（如脂肪酸、甾醇），这些成分在化妆品等领域可能有应用价值。分子网络技术为可视化结构相关的代谢物簇和识别潜在的未知化合物提供了强大工具。

该研究的重要意义在于为咖啡加工副产物的资源化利用提供了科学依据和技术框架。通过理解溶剂-原料-代谢物谱之间的关系，可以有针对性地选择提取条件和原料，以最大化目标生物活性化合物的回收，从而推动咖啡废弃物在营养保健品、化妆品和个人护理产品等高附加值领域的应用。此外，研究所展示的多组学数据分析整合策略（MN + 多变量统计 + 机器学习）也为其他复杂生物质废弃物的化学挖掘和价值评估提供了可借鉴的范例。未来研究可进一步结合靶向生物活性验证和毒理学评估，以确证特定应用场景的有效性和安全性。