基于荧光脂质体和补体活性的新型均质脂质体一步法检测方法在人血清中用于SARS-CoV-2抗体检测的开发

《Analytical Chemistry》：Development of a Novel Homogeneous Liposome-Based One-Step Assay for SARS-CoV-2 Antibody Detection in Human Serum Based on Fluorescent Liposomes and Complement Activity

开发了一种无需洗涤的脂体传感器，通过SARS-CoV-2 RBD蛋白修饰脂体并封装荧光染料，抗体结合激活补体系统导致脂体破裂，释放荧光信号实现定量检测。该方法灵敏度为93%、特异性95%，与ELISA和pVNT相关性良好（R2=0.72-0.82），适用于高通量、便携式免疫诊断，并扩展至其他病毒检测。

　　本研究介绍了一种基于脂质体的均相免疫检测方法，用于在患者血清中定量检测针对SARS-CoV-2的抗体。这种方法相较于传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）等方法具有显著的优势，如无需洗脱步骤，简化了检测流程，并且能够在较短时间内获得定量结果。该方法通过将SARS-CoV-2的刺突蛋白受体结合域（RBD）共价偶联到荧光脂质体上，使得抗体与脂质体结合后能够激活补体系统，进而导致脂质体破裂，释放出自猝灭型荧光染料，从而实现对抗体浓度的定量分析。

抗体在诊断和疾病预测中扮演着至关重要的角色，尤其是在传染病的监测、疫苗效果评估以及免疫状态的判断方面。然而，传统方法往往需要多个孵育和洗脱步骤，这不仅增加了操作的复杂性，还可能影响检测的效率和准确性。因此，开发一种简单、快速且具有高灵敏度和特异性的检测方法显得尤为重要。本研究提出的脂质体检测方法，不仅避免了这些繁琐的步骤，还能够在1小时内完成检测，为大规模、快速的免疫诊断提供了新的思路。

该方法的核心在于利用脂质体作为病毒模拟物，通过补体系统激活实现抗体的检测。具体来说，当患者血清中的抗体与脂质体表面的RBD结合后，会触发补体系统的激活，形成膜攻击复合物，导致脂质体破裂并释放出荧光染料。这种释放过程与抗体浓度成正比，从而实现了对抗体浓度的定量分析。同时，由于该方法依赖于补体系统的活性，因此不仅能够检测抗体的结合能力，还能间接评估其激活补体系统的潜力，这在病毒中和实验中具有重要意义。

为了确保检测的准确性和可靠性，研究团队对脂质体的合成、表面修饰、稳定性和检测条件进行了系统的优化。首先，通过调整RBD的表面覆盖度，发现0.5 mol%的RBD覆盖能够达到最佳的结合效果和补体激活能力。此外，研究还发现，脂质体的稳定性与胆固醇含量密切相关，当胆固醇含量超过一定比例时，脂质体会因稳定性下降而出现聚集或泄漏现象。因此，选择适当的脂质组成对于维持脂质体的性能至关重要。

在实际应用中，研究团队对脂质体检测方法的性能进行了严格的验证。通过测试37份SARS-CoV-2阴性血清样本和28份阳性样本，结果显示该方法具有高达95%的特异性与93%的敏感性，且与传统的诊断ELISA方法和伪病毒中和试验（pVNT）之间表现出良好的相关性。这种相关性不仅验证了方法的准确性，也表明该方法在实际应用中具有广泛的适用性。

为了提高检测的稳定性，研究还对脂质体的储存条件进行了优化，发现添加0.05 wt%的牛血清白蛋白（BSA）能够显著提高脂质体的长期稳定性，防止其在储存过程中发生聚集或泄漏。此外，针对商业化补体来源中可能存在的干扰因素，研究团队采用了一种结合蛋白A的净化方法，有效去除了其中的抗SARS-CoV-2抗体，从而避免了假阳性信号的产生。尽管这种方法可能会导致补体活性的显著下降，但通过增加补体的使用量，可以有效地补偿这一损失。

在检测条件的优化方面，研究团队发现补体的浓度和孵育温度对检测结果具有重要影响。当补体浓度增加至10 vol%时，能够达到最佳的补体激活效果，同时保持脂质体在无患者血清时的“隐身”特性，避免非特异性裂解。此外，37 °C的孵育温度能够促进抗体与脂质体的结合和补体系统的激活，从而提高检测的灵敏度。

为了进一步验证该方法的可行性，研究团队还测试了其在不同疾病背景下的适用性，包括自身免疫性疾病和心血管疾病等。结果显示，该方法在这些复杂背景下仍能保持良好的特异性与灵敏度，且未出现与流感等其他病毒的交叉反应。这表明该方法不仅适用于SARS-CoV-2的检测，也具备扩展到其他病毒检测的潜力。

此外，研究团队还探讨了该方法在临床和研究中的应用前景。由于该方法无需洗脱步骤，操作简便，适合在高通量检测中使用。同时，该方法可以进一步发展为点对点（POC）检测平台，提高检测的可及性和便捷性。考虑到补体系统的个体差异，未来还可以探索利用患者自身的补体系统进行脂质体裂解，从而更全面地评估抗体在个体中的中和能力，以及其与补体系统之间的相互作用。

综上所述，这项研究成功开发了一种基于脂质体的均相检测方法，用于定量检测针对SARS-CoV-2的抗体。该方法不仅简化了检测流程，还提高了检测的效率和准确性，为未来免疫诊断技术的发展提供了新的思路。随着对补体系统和抗体功能研究的深入，该方法有望在更广泛的疾病监测和免疫评估中发挥重要作用，特别是在大规模筛查和个性化医疗领域。