改进小麦细菌和真菌内生菌群的分析方法——一种PCR夹心技术

《Frontiers in Microbiology》：Improving the profiling of wheat bacterial and fungal endophytic communities—a PCR clamping approach

小麦内生微生物群组分析中，宿主DNA共扩增严重干扰测序结果。本研究开发新型PCR钳（阻断引物和PNA）抑制小麦DNA扩增，通过V5V7和V4区域16S rRNA基因及ITS1/ITS2真菌基因靶向设计，验证PNA在99.8%细菌和94%真菌 reads中的高效性，并建立标准化方法。

　　小麦（*Triticum aestivum*）是全球重要的粮食作物之一，占据了超过27%的世界谷物产量。随着气候变化和病原体压力对农业系统带来的挑战日益加剧，理解影响小麦健康和产量的因素变得尤为重要。近年来，研究者发现，植物内部的内生微生物群落对促进植物生长、增强营养吸收以及提升抗病能力具有关键作用。特别是在小麦中，这些内生微生物群落对于防控如*Zymoseptoria tritici*斑点病和*Fusarium*穗腐病等主要真菌病害至关重要。由于内生微生物对植物的健康和产量具有显著影响，因此开发能够准确表征其组成的工具是十分必要的。

当前，最常用的技术是基于扩增子的高通量测序（HTS），也被称为元条形码（metabarcoding）。这种方法通过扩增微生物基因组中的特定区域，对大批量样本进行微生物组成分析。对于古菌和细菌，通常扩增16S rRNA基因的某些高变区，而对于真菌，则常使用核糖体基因的内部转录间隔区（ITS）的一部分或18S/28S rRNA基因。通过这样的扩增，可以获得数百万条测序数据，经过生物信息学处理后，可以推断出样本的分类组成并评估多样性指标。这种技术不仅快速，而且成本相对较低，适用于广泛的研究场景。

然而，在对内生微生物群落进行元条形码分析时，植物组织通常被粉碎以提取总DNA，并进行后续的扩增。由于植物自身的DNA也会被扩增，这常常成为干扰因素。例如，小麦的叶绿体16S rRNA基因和线粒体18S rRNA基因与细菌的16S rRNA基因存在高度相似性，而植物的ITS、18S和28S rRNA基因区域也与真菌的相应区域表现出类似模式。这种同源性导致了微生物靶向区域的扩增过程中，植物DNA也被大量扩增，从而显著干扰了微生物群落的分析。这种现象使得在没有特定处理的情况下，测序结果中植物序列占主导地位，微生物序列仅占很小一部分，从而限制了对微生物多样性的准确评估。

为了解决这一问题，研究者们尝试了多种策略，包括增加测序深度和在生物信息学处理阶段去除植物序列。然而，这些方法往往成本高昂，且不能保证足够的微生物测序深度。此外，植物DNA的持续扩增可能导致微生物多样性仍被低估或出现偏差。因此，寻找一种能够在PCR过程中直接减少植物DNA扩增的策略显得尤为重要。

一种可能的解决方案是使用PCR夹子（PCR clamps），即设计特殊的寡核苷酸分子以阻止非目标DNA的扩增。这类夹子可以是“阻断引物”或“肽核酸”（PNA）。阻断引物与传统引物类似，但在其3′端具有一个C3间隔子，这会阻止磷酸二酯键的形成，从而阻止引物延伸。而PNA则是一种核苷酸类似物，其糖-磷酸骨架被肽类骨架取代，但仍能与互补的DNA或RNA序列高度特异性地结合。由于PNA不带电荷，它们能够形成比DNA-DNA双链更稳定的PNA-DNA双链，从而更有效地阻止非目标序列的扩增。尽管PNA在阻断非目标DNA方面表现出更高的效率，但其成本相对较高。相比之下，阻断引物则是一种更为经济的选择。

本研究旨在开发新的PCR夹子系统，用于研究与小麦相关的内生微生物群落。考虑到小麦在全球粮食和饲料产业中的重要性，研究选择了面包小麦（*Triticum aestivum ssp. aestivum*）作为宿主模型。我们探索了PNA和阻断引物两种选项，开发了四种不同的夹子系统，分别针对细菌16S rRNA基因的V4和V5V7区域，以及真菌DNA的ITS1和ITS2区域。此外，我们还构建了平衡和不平衡的细菌与真菌模拟群落，以验证夹子对微生物DNA扩增的无抑制作用。

在实验过程中，我们首先收集了多个小麦叶片，并在液氮中粉碎以提取DNA。随后，使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒提取总DNA，并通过Qubit 4荧光计和NanoDrop One分光光度计进行浓度和质量的测定。我们还使用了阴性对照，以确保DNA提取和PCR过程中没有污染。接着，我们构建了模拟群落，其中包括17种与小粒谷物相关细菌的DNA，以及14种与小麦或其他谷物相关的真菌DNA。这些模拟群落用于评估夹子是否能够有效减少植物DNA的扩增，同时不影响微生物DNA的扩增效率。

在细菌16S rRNA基因的V5V7区域扩增中，我们使用了799F/1193R引物对，这些引物能够防止小麦叶绿体DNA的扩增。然而，它们仍然能够扩增线粒体DNA。因此，我们开发了两种类型的阻断引物（BL_*)和PNA（PNA_V5V7），以评估它们在阻止植物DNA扩增方面的效率。结果显示，PNA_V5V7在阻止植物DNA扩增方面表现更优，能够实现接近100%的细菌序列回收率，而阻断引物则表现出67-98%的效率，但成本更低。基于这些结果，我们选择了PNA作为后续开发的首选策略，针对16S rRNA基因的V4区域以及真菌ITS1和ITS2区域分别设计了PNA_V4chloro和PNA_V4mito。此外，我们还设计了PNA_ITS1和PNA_ITS2，以针对真菌的ITS1和ITS2区域。

在实验过程中，我们测试了18种不同的PCR系统，包括针对细菌和真菌的扩增。每种PCR系统进行了九次重复实验，最终形成了三个独立的测序库。通过高通量测序（Illumina MiSeq设备），我们获得了大量的测序数据，并利用QIIME2进行生物信息学分析。在处理过程中，我们使用了DADA2算法对原始数据进行去噪，生成扩增子序列变异（ASVs），并根据质量图对读数进行截断处理。我们还使用了q2-feature-classifier工具对ASVs进行分类，并与不同的参考数据库进行比对。对于细菌的16S rRNA测序数据，我们使用了SILVA 138 SSU数据库，而对于真菌的ITS序列，我们构建了一个定制的参考数据库，包含了从NCBI获取的植物和真菌ITS序列。

实验结果显示，未使用夹子的扩增导致了严重的植物DNA干扰，使得测序结果中植物序列占主导地位，微生物多样性被显著低估。而使用夹子后，植物序列的干扰得到了有效控制，微生物多样性得以准确恢复。在V5V7和V4区域的扩增中，夹子的使用显著提高了微生物读数的比例，同时也增加了多样性指标的准确性。此外，我们还测试了模拟群落，以验证夹子对微生物DNA扩增的无抑制作用。结果显示，即使在低比例的微生物序列中，夹子也未表现出抑制效应，表明它们对微生物DNA的扩增没有负面影响。

在讨论部分，我们强调了夹子在小麦内生微生物群落研究中的重要性。首先，本研究首次提出了一个经过验证的夹子集合，能够准确表征小麦内生细菌和真菌群落，为研究提供了更全面的视角。其次，通过在多个微生物类别中使用至少两个夹子（如细菌的V4和V5V7区域，真菌的ITS1和ITS2区域），我们确保了结果的稳健性和可靠性。此外，我们还通过实验验证了夹子对微生物DNA扩增的无抑制作用，这是之前研究中未涉及的重要验证步骤。

我们还指出，使用阻断引物在某些情况下可能不如PNA有效，尤其是在处理复杂样品时。然而，阻断引物在成本方面具有优势，因此仍然是一个值得探索的替代方案。我们进一步讨论了夹子在不同PCR区域中的适用性，例如V3V4、V3V5、V4V5和V6V8区域的引物对，这些引物虽然针对略有不同的16S区域，但它们的扩增区域与我们开发的夹子具有重叠，因此这些夹子也可以用于类似的实验设计。同样，对于真菌的ITS1和ITS2区域，我们设计的夹子可以适用于多种常用的引物对。

此外，我们还探讨了“通用”夹子在实际应用中的局限性。尽管已有研究开发了适用于多种植物的通用PNA夹子，但这些夹子在某些情况下（如非Asteraceae植物）可能会增加植物DNA的共扩增。这表明，针对特定宿主设计的夹子在确保准确性和可靠性方面更为有效。我们还指出，植物DNA可能通过整合到核基因组中而产生干扰，这种现象在我们的实验中也有所体现。因此，开发针对特定宿主的夹子是当前研究的重点。

最后，我们强调了本研究方法的可扩展性。我们不仅为小麦开发了夹子系统，还详细描述了开发过程，以便其他研究者能够将这种方法应用于其他宿主物种。通过提供清晰的指导方针，我们希望促进该技术在微生物群落研究中的广泛应用。此外，我们还指出，随着第三代测序技术的发展，未来可能能够对完整的16S-ITS-23S或18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S等更大的基因片段进行测序，从而进一步提高分类分辨率。这些新技术的发展将为微生物群落研究提供更全面的视角，而我们开发的夹子同样适用于这些更复杂的测序策略。

综上所述，本研究不仅解决了小麦内生微生物群落研究中的关键问题，还为其他宿主物种的夹子开发提供了实用的方法论。通过使用PNA夹子，我们能够有效减少植物DNA的干扰，同时保持微生物DNA的扩增效率。这一成果为农业微生物学研究提供了重要的工具，并有助于更准确地评估微生物群落的多样性及其在植物健康和产量中的作用。