利用纳米孔测序技术对Mycoplasma agassizii进行多基因座序列分型：揭示其遗传多样性及分离株特征

《Annals of the New York Academy of Sciences》：Mycoplasma agassizii Multilocus Sequence Typing Using Nanopore Sequencing: Insights Into Genetic Diversity and Isolate Characterization

Mycoplasma agassizii是陆龟上呼吸道疾病的主要病原体，本研究通过设计基于8个管家基因的MLST方案，结合纳米孔测序技术，分析了意大利和葡萄牙127份样本，发现57.5%呈阳性，包含14种不同的序列类型（ST），其中uvrB、gyrB、rpoB和gmK四个基因可完全区分所有ST。研究揭示了M. agassizii的高遗传多样性及部分克隆与重组共存的现象，为疾病防控和种群保护提供了工具基础。

　　这项研究聚焦于一种名为 *Mycoplasma agassizii*（*M. agassizii*）的细菌，它被认为是导致陆龟上呼吸道疾病（Upper Respiratory Tract Disease, URTD）的主要病原体之一。这种疾病的出现不仅对陆龟的健康构成严重威胁，还与全球范围内陆龟种群数量的下降密切相关。尽管 *M. agassizii* 的影响已被广泛认知，但目前仍缺乏有效的工具用于区分不同菌株以及追踪其传播模式。因此，本研究提出了一种基于多基因位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST）的方法，结合纳米孔测序技术，以期能够更全面地分析该细菌的遗传多样性及其在陆龟种群中的流行病学特征。

### 一、研究背景与意义

陆龟作为地球上存在了约2.2亿年的生物，它们在维持生态系统平衡方面发挥着重要作用。它们参与了种子传播、碳储存以及矿物质循环等关键生态过程，是全球生物多样性的组成部分之一。然而，近年来陆龟种群数量持续减少，这种现象主要受到人为环境变化和病原体传播的双重影响。例如，气候变化导致的栖息地丧失、人类活动对自然栖息地的侵占、非法宠物贸易、以及传统医学中对陆龟制品的使用等，都对陆龟生存构成威胁。此外，外来入侵植物的引入和气候变化共同加剧了野生环境中的火灾频率和强度，进一步破坏了陆龟的生存条件。

在这些威胁中，由细菌引起的疾病，尤其是 *M. agassizii* 所致的上呼吸道疾病（URTD），对陆龟的健康状况产生了显著影响。该疾病在陆龟中表现出多种症状，包括鼻部分泌物、眼睑水肿、过度流泪、眼部分泌物增多、结膜炎以及上呼吸道黏膜病变等。在严重情况下，该病可能导致陆龟活动力下降，甚至死亡。因此，深入理解 *M. agassizii* 的遗传特征和其在不同陆龟种群中的传播情况，对于制定有效的保护和疾病防控措施具有重要意义。

*M. agassizii* 最初被发现与上呼吸道疾病有关，最早在北美的沙漠和地鼠类陆龟中被报道。随后，它在多个陆龟物种中被检测到，包括自由生活的和圈养的个体。随着研究的深入，该细菌的分布范围已经扩展到欧洲和非洲，显示出其在不同地理区域和宿主种类中的广泛存在。值得注意的是，*M. agassizii* 的感染形式并不总是具有明显的临床表现，它可能以亚临床形式存在，这使得该病原体的检测和控制变得更加复杂。此外，一些陆龟在感染后可能会经历康复与复发的周期，进一步增加了疾病的传播风险。

目前，对于 *M. agassizii* 与陆龟死亡率、发病率及种群可持续性之间的关系，仍缺乏系统的了解。尤其是，关于其致病机制以及不同菌株在疾病发展中的作用，仍然存在许多未解之谜。因此，开发一种高效的菌株识别和流行病学追踪工具，对于理解 *M. agassizii* 的传播路径和评估其对陆龟种群的影响至关重要。

### 二、研究方法与技术手段

本研究采用了一种基于多基因位点序列分型（MLST）的方法，结合纳米孔测序技术，对 *M. agassizii* 的菌株进行分析。首先，研究人员从意大利和葡萄牙的陆龟样本中收集了127份样本，其中73份（占57.5%）通过PCR检测确认为 *M. agassizii* 阳性。这些样本来源于野生动物救助中心、动物园以及私人饲养者。随后，研究人员选择了八个管家基因（*uvrB*、*tpiA*、*gyrB*、*efTu*、*rpoB*、*uvrA*、*gmK* 和 *atpG*）用于MLST分析，并利用纳米孔测序技术对这些基因进行测序。

管家基因的选择基于其在细菌基因组中的高度保守性，这使得它们在不同菌株之间的比较具有可行性。为了提高分析的准确性，研究人员还通过传统的Sanger测序方法对PCR产物进行了验证。此外，为了评估不同基因位点的区分能力，研究团队采用了Simpson指数和标准化关联指数（I_a）等指标，这些指标有助于判断菌株之间的遗传差异是否显著。最终，研究人员发现仅需四个基因位点（*uvrB*、*gyrB*、*rpoB* 和 *gmK*）即可在H_d ≥ 0.83的多样性阈值下区分所有14种序列类型（STs），表明这些基因在区分 *M. agassizii* 菌株方面具有较高的可靠性。

### 三、研究结果与发现

通过对15个分离株的分析，研究人员发现这些菌株在遗传多样性方面表现出高度差异，即使在相同的救助中心中，不同个体之间的遗传特征也各不相同。这表明 *M. agassizii* 在陆龟种群中具有广泛的遗传多样性，而不仅仅是局限于某些特定的地理区域或宿主种类。此外，研究发现不同STs之间没有明显的地理或宿主特异性分布，这可能与陆龟之间的混养、不完善的卫生条件、以及缺乏严格的健康筛查等因素有关。

在对不同基因位点的分析中，研究人员发现 *uvrB* 基因表现出最高的遗传变异，拥有84个多态性位点，形成了11种不同的等位基因。相比之下，*uvrA* 基因虽然多态性位点也较多，但等位基因数量较少，仅有6种。这种基因位点之间的差异提示了某些基因可能在菌株区分中具有更重要的作用。同时，研究还发现，尽管某些基因位点（如 *efTu* 和 *uvrA*）在某些分离株中表现出一致性，但其他基因位点则提供了更多的遗传信息。

此外，通过构建系统发育树，研究人员发现不同STs之间并没有明确的地理或宿主特异性分化。这表明 *M. agassizii* 的传播可能不仅仅依赖于地理隔离，而是更多地受到宿主之间的接触、环境因素以及细菌自身的传播能力的影响。研究团队还发现，某些STs（如ST13）在葡萄牙样本中与美国的723菌株（ST2）共享相同的 *rpoB* 等位基因，这提示了不同地区之间可能存在菌株的交流或传播。

### 四、讨论与意义

研究结果表明，*M. agassizii* 在陆龟种群中具有显著的遗传多样性，这种多样性不仅体现在不同地理区域之间，也体现在同一救助中心内的不同个体之间。这种现象可能与多种因素有关，包括不同陆龟之间的相互接触、不卫生的饲养环境、以及可能的非法贸易行为。然而，由于样本数量有限，这些推测仍需进一步验证。

此外，研究团队发现，尽管 *M. agassizii* 的传播似乎具有一定的随机性，但其种群结构仍显示出一定程度的克隆特性。标准化关联指数（I_a = 0.2246）表明，虽然存在一定程度的基因重组，但这种重组并不足以完全打破基因型之间的关联。这可能意味着 *M. agassizii* 的遗传变异主要来源于垂直遗传，而水平基因转移或重组事件相对较少。

研究还强调了MLST方法在细菌分类和流行病学分析中的应用潜力。通过分析多个基因位点，可以更准确地识别不同的菌株，并进一步探讨它们与疾病表现之间的关系。这不仅有助于理解 *M. agassizii* 的传播机制，还能为陆龟的疾病防控提供科学依据。例如，通过区分具有不同致病性的菌株，可以更有效地制定针对性的防控措施，减少不必要的疾病传播。

然而，目前的研究样本数量相对有限，这可能影响结论的普遍性。因此，未来的研究需要扩大样本范围，特别是对表现出URTD症状的陆龟进行更全面的检测。此外，研究还建议在更广泛的陆龟种群中应用该MLST方法，以进一步验证其在不同地理区域和宿主种类中的适用性。这将有助于揭示 *M. agassizii* 在陆龟种群中的真实传播模式，并为保护陆龟种群提供更精准的科学支持。

### 五、结论与展望

本研究提出了一种基于八个管家基因的MLST方案，结合纳米孔测序技术，为 *M. agassizii* 的菌株鉴定和流行病学分析提供了新的方法。这一方案在区分14种不同的序列类型方面表现出良好的效果，同时揭示了该细菌在陆龟种群中的遗传多样性。尽管当前研究的样本数量有限，但该方法为未来更深入的研究奠定了基础。

未来的研究应进一步扩大样本规模，特别是对那些表现出URTD症状的陆龟进行分析。这将有助于更准确地评估不同菌株对疾病严重程度和传播能力的影响。此外，该MLST方法还可以用于追踪非法贸易活动，从而为陆龟的保护提供更多的信息支持。因此，本研究提出的MLST方案具有重要的应用价值，它不仅有助于理解 *M. agassizii* 的遗传特征，还能为陆龟疾病的防控和保护工作提供科学依据。

总的来说，这项研究为陆龟疾病的分子流行病学分析提供了重要的工具，并为未来进一步探索 *M. agassizii* 的致病机制和传播路径奠定了基础。通过结合先进的测序技术，研究人员能够更精确地识别和区分不同的菌株，这将有助于制定更加有效的疾病防控和保护策略。未来的研究应继续扩大样本范围，深入探讨不同菌株与疾病表现之间的关系，以期为陆龟的健康保护提供更全面的科学支持。