综述：利用原核生物氨基酸转运蛋白进行代谢工程：机制与生物技术应用

《Systematic and Applied Microbiology》：Harnessing prokaryotic amino acid transporters for metabolic engineering: mechanisms and biotechnological applications

本综述系统总结了原核生物氨基酸转运蛋白的生理特性及其在高性能微生物菌株代谢工程中的应用，重点阐述了如何通过增强底物摄取、增加前体供应、直接促进氨基酸转运及减少竞争代谢通量等策略开发产氨基酸菌株，为构建高效微生物平台生产氨基酸和高价值生物制品提供理论指导。

　　

引言

氨基酸是构成生命体基本组成部分的有机分子，在细胞生长、发育和代谢调节中发挥至关重要的作用。它们广泛应用于食品、医药和农业等多个领域。随着公众健康营养意识的增强及国家政策的支持，氨基酸市场需求持续稳定增长，使其生产成为高度动态和突出的研究领域。目前氨基酸生产主要依赖蛋白水解提取、化学合成和微生物过程（酶催化与发酵）。其中微生物发酵作为主导工业方法，利用专一菌株在温和条件下生成L型产品，具有高产率、低降解和通过菌株及工艺优化可扩展等优势。

1. 原核微生物氨基酸转运蛋白概述

氨基酸构成一个庞大而多样的家族，包括18种蛋白质氨基酸和众多非蛋白质氨基酸。根据代谢起源，可将其分为五大类：天冬氨酸家族、丙酮酸家族、谷氨酸家族、丝氨酸家族和芳香族氨基酸。氨基酸转运蛋白是介导氨基酸跨细胞膜输入和输出的膜蛋白。当前研究主要聚焦于其结构、调控机制、与疾病关联及药物开发潜力。阐明这些转运蛋白在代谢工程框架内的功能、运输机制及其表达调控途径，将促进产氨基酸菌株的开发并提升其工业价值。目前工业氨基酸生产主要利用谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）和大肠杆菌（Escherichia coli），因此后续讨论将集中于此两种生物。

1.1. 参与L-天冬氨酸家族氨基酸摄取与输出的膜转运蛋白

天冬氨酸家族氨基酸衍生自草酰乙酸，包括L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸和L-异亮氨酸。这些氨基酸在食品、化妆品和制药等行业中作为必需添加剂和治疗成分被广泛使用，全球需求极高。

L-天冬氨酸和L-天冬酰胺作为非必需氨基酸，可由其他氨基酸内源合成。大肠杆菌中的AspT（天冬氨酸转运蛋白）作为可逆的天冬氨酸/丙氨酸反向转运体，介导L-天冬氨酸的跨膜转运。枯草芽孢杆菌的YveA是酸/多胺/有机阳离子超家族转运蛋白，含14个预测跨膜段（TMSs），能转运L-天冬氨酸和L-谷氨酸，并对L-天冬氨酸羟化盐敏感。YdeD属于PecM转运蛋白家族，与RhtB和SetA等结构相似，促进L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺的出口，帮助调节细胞内氨基酸浓度。

L-赖氨酸是必需氨基酸，在食品、动物饲料和制药中应用广泛。在谷氨酸棒状杆菌中，LysE超家族蛋白是一系列跨膜转运蛋白，催化氨基酸、脂质和重金属离子的跨膜转运。LysE由lysE编码，主要促进L-赖氨酸从细胞内到细胞外的输出，并涉及其他碱性氨基酸如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的转运，但其在L-鸟氨酸转运中的作用存在争议。在大肠杆菌中，ArgO是LysE的同源物，也能转运L-赖氨酸；YbjE则作为细胞内L-赖氨酸的输出器。由于谷氨酸棒状杆菌是L-赖氨酸生产的主要菌株，研究多集中于LysE，其他原核生物的运输系统少有记载。

L-苏氨酸是必需氨基酸，常用于动物饲料，在蛋白质合成和各种生理过程中起关键作用。大多数原核生物拥有特定的L-苏氨酸运输系统。谷氨酸棒状杆菌中的SerE由serE编码，作为苏氨酸转运蛋白，类似于药物/代谢物转运蛋白超家族的渗透酶，形成10个跨膜螺旋，促进L-苏氨酸和L-丝氨酸从细胞内到细胞外的运输。ThrE是谷氨酸棒状杆菌中L-苏氨酸和L-丝氨酸出口的关键促进因子，其过表达显著增强细胞外积累。在大肠杆菌中，RhtA、RhtB和RhtC介导L-苏氨酸的转运，其中RhtC对L-苏氨酸具有特异性。

L-甲硫氨酸是含硫必需氨基酸，具有重要生物学功能。大肠杆菌中，高亲和力转运蛋白MetD和低亲和力转运蛋白MetP属于ABC（ATP结合盒）超家族，负责将细胞外L-甲硫氨酸导入细胞。MetNI在高亲和力下运作，当细胞内L-甲硫氨酸浓度显著低于150 μM时效率最高。谷氨酸棒状杆菌中，BrnFE介导L-甲硫氨酸的出口，这是一种对脂肪族疏水氨基酸具有高特异性的双组分跨膜转运蛋白，也负责L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的输出，该过程受全局转录因子Lrp调控。

L-异亮氨酸是支链氨基酸（BCAAs）之一，在肌肉代谢和能量生产中起重要作用。谷氨酸棒状杆菌中，BrnFE主要介导L-异亮氨酸的输出，而BrnQ是其摄取的主要载体。删除brnQ会显著减少细胞对L-异亮氨酸的吸收。大肠杆菌中，YgaZH转运蛋白负责将L-异亮氨酸和L-缬氨酸从细胞内环境输出到细胞外空间，对细胞内L-异亮氨酸和L-缬氨酸水平的调节至关重要。

1.2. 参与丙酮酸家族氨基酸摄取与输出的膜转运蛋白

丙酮酸是糖酵解途径的关键中间体，作为几种重要氨基酸合成的关键前体，参与L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸的生产。

L-丙氨酸通过转氨反应合成，其中丙酮酸捐赠氨基，通常来自L-谷氨酸。大肠杆菌中的AlaE转运蛋白是D-丙氨酸的主要外排系统，也能利用质子势输出L-丙氨酸。该转运蛋白由149个氨基酸残基组成，包括四个预测跨膜结构域和三个带电氨基酸残基。alaE的表达受全局转录因子Lrp（亮氨酸响应蛋白）调控。当alaE插入谷氨酸棒状杆菌基因组时，显著加速L-丙氨酸向细胞外空间的分泌。

L-缬氨酸对动物健康和新陈代谢至关重要。除BrnFE系统外，另一个关键蛋白是亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸结合蛋白（LIVBP），它是外膜中结合蛋白家族的组成部分，促进支链氨基酸进入细胞。该蛋白与质膜蛋白LivH、LivM和LivG协同作用，形成运输复合体，帮助将支链氨基酸从细胞外空间转移进细胞。

L-亮氨酸是重要的支链氨基酸，在食品、动物饲料添加剂、化妆品成分和医疗领域有广泛应用。大肠杆菌中过表达yeaS可加速细胞内L-亮氨酸向细胞外环境的输出。

1.3. 参与L-谷氨酸家族氨基酸摄取与输出的膜转运蛋白

L-谷氨酸家族氨基酸衍生自三羧酸循环中的中间代谢物α-酮戊二酸，包括L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸和L-精氨酸。

L-谷氨酸由α-酮戊二酸通过转氨作用形成，是谷氨酸氨基酸家族的核心成员。在生物体中，谷氨酸不仅是蛋白质合成的基本构建块，还在碳氮代谢、能量调节和信号转导中起关键作用。谷氨酸棒状杆菌中，两个机械敏感跨膜通道蛋白MscCG和MscCG2介导L-谷氨酸转运，两者属于MscS亚家族，由膜脂张力激活，无需ATP水解即可实现L-谷氨酸转运。MscCG于2010年被鉴定为主要L-谷氨酸转运蛋白，在高渗条件下作为“泵漏”机制中的被动但受调节的外排通道。MscCG2在2018年被发现具有类似的L-谷氨酸转运能力。两者仅共享23%的氨基酸序列相似性，表明MscCG2独立于MscCG进化。

L-脯氨酸在生物医学、食品生产和化妆品中具有广泛应用 due to其独特生化性质和生理功能。谷氨酸棒状杆菌中的转运蛋白NCgl2533被鉴定为低细胞毒性氨基酸转运蛋白，负责L-脯氨酸的跨膜输出，属于苏氨酸/丝氨酸出口家族，作为质子驱动转运蛋白运作。其结构为单个多肽，在C端区域有9或10个跨膜α螺旋，N端有一个保守的亲水结构域。NCgl2533具有广泛的底物特异性，能转运各种氨基酸包括L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸和L-脯氨酸。相比之下，大肠杆菌中的L-脯氨酸转运蛋白PutP通过不同机制运作，作为钠/溶质同向转运蛋白家族（SSF）成员，利用Na⁺依赖的主动运输系统将L-脯氨酸从细胞外环境导入细胞质。

L-精氨酸广泛应用于食品和制药行业。大肠杆菌中，L-精氨酸转运蛋白YggA由yggA编码，能够将细胞内L-精氨酸输出到细胞外环境。另一个重要的L-精氨酸转运蛋白是AdiC，属于氨基酸/多胺/有机阳离子转运蛋白超家族，是原核生物中溶质载体SLC7家族的一部分。AdiC是L-精氨酸依赖酸抗性系统的组成部分，使大肠杆菌能在高酸条件下存活。AdiC通过符合交替访问机制的构象循环双向交换L-精氨酸。其结构在去污剂胶束和脂膜中形成同型二聚体，每个单体作为独立转运蛋白，由12个跨膜α螺旋和细胞内N端和C端结构域组成。二聚体界面有一个水填充腔，主要内衬疏水残基（如F84、L85、V363、L366、F414、L417、M418）和极性残基（包括Q88、Y367、T421），共同促进底物识别和转运动力学。谷氨酸棒状杆菌中，CgmA被鉴定为L-精氨酸输出器，属于L-谷氨酸相关转运蛋白家族。

1.4. 参与L-丝氨酸家族氨基酸摄取与输出的膜转运蛋白

L-丝氨酸是衍生自糖酵解中间体3-磷酸甘油的重要氨基酸，作为前体可进一步代谢为L-甘氨酸和L-半胱氨酸。这些氨基酸具有重要的生理和工业功能，其中甘氨酸和半胱氨酸年需求超过万吨，丝氨酸需求也达每年3000吨以上。

L-丝氨酸是非必需、天然存在的氨基酸，在细胞代谢、蛋白质合成和生物合成途径中起关键作用，是几种重要生物分子（包括L-甘氨酸、L-半胱氨酸、鞘脂、磷脂酰丝氨酸和嘌呤）的前体。由于其在新陈代谢调节、皮肤水合和神经功能中的重要作用，L-丝氨酸广泛应用于制药和化妆品行业。大肠杆菌中，过表达EamA（一种L-半胱氨酸转运蛋白）也促进L-丝氨酸输出，表明L-丝氨酸和L-半胱氨酸的结构相似性使某些膜蛋白能够交叉特异性转运。关于L-丝氨酸在大肠杆菌中的摄取，多个基因包括sdaC、cycA、sstT和tdcC编码负责导入L-丝氨酸的膜转运蛋白。其中sdaC作用突出，引入含sdaC的多拷贝质粒显著增强L-丝氨酸摄取效率。sstT基因编码钠离子梯度依赖转运蛋白，导入L-丝氨酸和L-苏氨酸。功能研究表明，删除sdaC和cycA导致L-丝氨酸积累增加，而敲除sstT和tdcC对L-丝氨酸生产影响最小。

L-半胱氨酸是具有重要生理功能的氨基酸，在医药、食品、动物饲料和化妆品行业有广泛应用。除YdeD外，YfiK是另一个关键半胱氨酸输出器，属于RhtB转运蛋白家族。在大肠杆菌中过表达yfiK显著增强发酵过程中半胱氨酸分泌。除这些次级转运蛋白外，细菌还利用ABC转运蛋白进行半胱氨酸输出。异源二聚ABC转运蛋白CydDC由CydD和CydC亚基组成，主要向细胞外空间输出巯基谷胱甘肽和L-半胱氨酸。该转运蛋白独特地与血红素辅因子相互作用，调节其ATP酶活性，以ATP依赖方式运作，利用ATP水解能量主动运输底物跨细胞膜。

1.5. 参与L-组氨酸和芳香族氨基酸摄取与输出的膜转运蛋白

芳香族氨基酸包括L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸，在全球氨基酸市场中占有重要份额。这些化合物及其衍生物由于在代谢和营养中的必需角色，被广泛应用于制药、食品生产和动物饲料配方等多个行业。L-组氨酸是另一种关键氨基酸，尤其在医疗领域有广泛应用，常作为静脉输液和特殊饮食的补充剂以支持有特定营养需求的患者。

L-组氨酸合成在大多数细菌中保守，通常从核苷酸前体磷酸核糖焦磷酸起始，经过一系列酶催化反应。一旦合成，L-组氨酸依赖高效运输系统确保适当摄取并维持细胞稳态。大肠杆菌中，HisP是ABC转运蛋白家族的膜结合核苷酸结合亚基，与三种膜结合蛋白形成高亲和力L-组氨酸转运复合体。值得注意的是，HisP转运L-组氨酸和L-精氨酸，证据表明它们的易位独立发生 without竞争。组氨酸结合位点位于周质空间，HisP在底物识别中起关键作用。另一个重要转运蛋白是AroP，大肠杆菌中的常见氨基酸渗透酶，主要以高亲和力转运三种芳香族氨基酸——苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。谷氨酸棒状杆菌中，AroP也作为L-组氨酸转运蛋白，显示中等亲和力，Km值为11.40 ± 2.03 μM，但L-组氨酸通过AroP的摄取受芳香族氨基酸竞争性抑制。此外，谷氨酸棒状杆菌的AroP对L-色氨酸显示出比L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-组氨酸更高的亲和力。结构分析显示，残基Ser24、Ala28和Gly29高度保守，在底物结合中起关键作用。

L-色氨酸是含吲哚环的芳香必需氨基酸。其生物合成源自莽草酸途径的一个分支，存在于细菌、真菌和植物等生物中，但动物缺乏。因此动物必须通过饮食或补充从外部来源获取L-色氨酸。大肠杆菌中，三种转运蛋白——Mtr、TnaB和AroP——参与从细胞外环境摄取L-色氨酸。其中Mtr和TnaB是色氨酸特异性转运蛋白。值得注意的是，Mtr是一种疏水膜蛋白，跨越质膜，在大肠杆菌K-12中对L-色氨酸高度特异。mtr的表达受TyrR调控蛋白复合体严格调控：当TyrR与L-苯丙氨酸或L-酪氨酸结合时，激活mtr表达；相反，当与L-色氨酸结合时，抑制mtr转录。相比之下，大肠杆菌中的YddG作为芳香族氨基酸的输出器。过表达yddG已被证明促进这些氨基酸的分泌，使其成为代谢工程中提高芳香族氨基酸产量的有用工具。

L-苯丙氨酸像L-色氨酸一样，生物合成源自莽草酸途径中的中间代谢物预苯酸。大肠杆菌中，L-苯丙氨酸的运输涉及多种转运系统。一个关键系统是支链氨基酸转运复合体，称为LIV-I/LS系统。该转运蛋白由两种细胞外结合蛋白——LIV-I结合蛋白和LS结合蛋白——以及膜嵌入组件LivH、LivM和LivG组成，形成易位通道。LIV-I/LS系统对L-苯丙氨酸显示高亲和力，Km值分别约为19 μM和30 μM。有趣的是，通过LIV-I/LS系统摄取L-苯丙氨酸受支链氨基酸L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸竞争性抑制，这些氨基酸共享此运输途径。除LIV-I/LS系统外，大肠杆菌拥有苯丙氨酸特异性转运蛋白PheP，一种由458个氨基酸残基组成的膜蛋白，约71%成分为非极性氨基酸，赋予强疏水性。结构上，PheP含12个跨膜螺旋，与芳香族氨基酸转运蛋白AroP有59.6%序列同源性。功能上，PheP优先转运L-苯丙氨酸 over其他芳香族氨基酸，如L-色氨酸，使其区别于具有更广底物特异性的其他转运蛋白。

L-酪氨酸是另一种衍生自预苯酸的芳香族氨基酸。除在蛋白质生物合成中的作用外，L-酪氨酸作为高价值天然酚类化合物（包括对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸）生物合成的代谢前体。L-酪氨酸跨细胞膜的高效运输对其代谢利用至关重要。大肠杆菌K-12中，转运蛋白TyrP对L-酪氨酸显示高特异性和亲和力。在翻译过程中，TyrP经历水解并整合到细胞膜中，采用与其他主要促进子超家族成员（如LacY、AraE和GalP）相似的跨膜拓扑。虽然一些转运蛋白显示严格底物特异性，但其他能够转运多种氨基酸。谷氨酸棒状杆菌中，虽未鉴定出具有相同底物特异性的TyrP同源物，但广谱芳香族氨基酸转运蛋白如TnaB也介导L-酪氨酸的跨膜运输。

2. 工程化转运蛋白以增强微生物氨基酸生产

基因编辑的进步使代谢工程成为开发产氨基酸微生物菌株的核心策略。通过合理应用代谢工程策略，可以微调代谢途径、优化能量供应系统和重建辅因子再生机制，从而最大化碳通量流向有价值化合物的生物合成。然而，随着代谢修饰的深入，产品的细胞内积累可能引发反馈抑制和细胞毒性，进而限制菌株的进一步改进。为克服这些瓶颈，增强产品从细胞内到细胞外的运输以及底物的摄取至关重要。通过促进分子跨细胞膜的双向运动，转运蛋白在此过程中起关键作用。在产氨基酸菌株背景下，转运蛋白可以促进目标氨基酸的外排，改善底物摄取和利用，抑制竞争途径的碳通量，并增强前体供应。因此，转运蛋白作为重塑细胞内代谢通量的多功能工具。通过运输系统工程，可以优化氨基酸生物合成，改善微生物性能，并为工业和农业目的提高产量。

2.1. 工程化膜蛋白以改善发酵底物的摄取

在氨基酸发酵背景下，底物摄取已被确定为影响氨基酸生物合成的关键因素。修饰膜蛋白已被证明可以增加氨基酸生物合成所需底物的细胞内摄取，确保氨基酸代谢的充足营养。例如，Wang等人研究编码甜菜碱相关膜蛋白的基因——proP、proVWX和betABIT——对大肠杆菌L-苏氨酸生产的影响。发现敲低这些甜菜碱相关蛋白增加了葡萄糖摄取相关基因的转录水平，并增强了细胞内NADH合成。这反过来确保了L-苏氨酸合成的充足底物和能量，从而增强了其生产。具体来说，敲低betABIT基因簇导致L-苏氨酸产量略有下降，而敲低proP或proVWX分别使L-苏氨酸产量增加33.3%和40%。同样，在谷氨酸棒状杆菌的代谢工程中，通过删除调控蛋白IolR激活非PTS葡萄糖运输系统是改善葡萄糖利用的常见策略。在我们之前的工作中，通过破坏IolR和在强启动子下过表达IolT1增强了葡萄糖运输系统。所得重组菌株谷氨酸棒状杆菌SO26在摇瓶发酵中显示L-鸟氨酸产量比起始菌株增加10%，最高达38.5 g/L。此外，Jian等人用异源基因glf替代大肠杆菌中的天然PTS葡萄糖运输系统，构建了大肠杆菌SP1.1pts/pSC6.090B。此修饰在高葡萄糖浓度下发酵48小时后，将莽草酸产量从52 g/L增加到71 g/L，证明了基因修饰提高莽草酸生产菌株生产力的潜力。

这些例子说明，修饰膜蛋白可以增强底物摄取，无论它们直接参与氨基酸的代谢合成。这表明这种修饰广泛适用。此方法不仅可以增加氨基酸产量，还可以减少非氨基酸产品合成所需底物的摄取。通过结合膜蛋白修饰增强底物摄取与减少竞争代谢途径的策略，可以将主要合成过程集中在目标氨基酸的合成上。

2.2. 膜蛋白工程改善目标氨基酸生产的前体供应

氨基酸生物合成依赖前体作为必需原材料，其可用性经常限制生产。充足的前体供应促进生物合成并增加氨基酸产量，而不足则限制生产。由于不同氨基酸需要不同的前体，包括糖、脂肪酸或其他氨基酸，优化前体供应是调节生产的关键策略。通过工程化膜蛋白增强前体运输，可以进一步加强此策略。例如，Yamazaki等人报告，改善L-胱硫醚运输显著提高了L-甲硫氨酸生产。他们表明YecS是负责L-胱硫醚摄取的唯一转运蛋白，并且在L-甲硫氨酸生产菌株WDBCDJK-24中过表达yecS增加了前体摄取，导致L-甲硫氨酸产量提高15%。同样，为增强L-鸟氨酸生产，我们之前破坏了谷氨酸棒状杆菌中的转运蛋白Ncgl1221和MscCG2，从而增加了关键前体L-谷氨酸的细胞内可用性。两种敲除有效促进了L-鸟氨酸生物合成并显著提高了产量。这些研究共同突出了转运蛋白工程在优化前体可用性和将代谢通量转向氨基酸方面的潜力。通过调控关键前体的进口和出口，可以改善途径效率并提高整体氨基酸生产。此策略可以扩展到多种微生物系统，为菌株代谢工程提供多功能和可持续的方法，以实现更高产量的氨基酸、酶和其他有价值代谢物。

2.3. 膜蛋白工程直接促进目标氨基酸的合成

产氨基酸细菌中的膜蛋白工程是增加目标氨基酸产量的直接且高效策略。通过过表达特定转运蛋白，此方法加速氨基酸跨膜通量，从而防止其细胞内过度积累。此类修饰防止氨基酸在细胞内过度积累，否则可能导致反馈抑制或产生对细胞有毒的高渗环境。通过控制氨基酸输出和优化前体利用，膜蛋白工程直接影响氨基酸生物合成的效率。

几项研究为此策略的有效性提供了令人信服的证据。Gu等人设计了一个重组大肠杆菌菌株过表达输出蛋白RhtC，导致L-苏氨酸产量比对照菌株增加50.2%。同样，Nanatani等人通过转运蛋白表达库筛选了两种转运蛋白——NCgl2533和NCgl0929。当这些蛋白引入大肠杆菌MLA301ΔalaE时，L-丙氨酸产量显著增强。这些案例例示了合理选择和过表达转运蛋白如何通过促进高效输出和防止细胞内积累来有效提高氨基酸产量。

除基于库的筛选外，比较基因组学已被证明是识别关键转运蛋白的有效方法。Zhang等人比较了参与L-丝氨酸输出的同源蛋白，并证明敲低Ncgl0580使L-丝氨酸产量减少56.5%。过表达Ncgl0580恢复了生产，证实了其在L-丝氨酸输出中的重要作用。同样，Wang等人使用CRISPR干扰筛选大型转运蛋白库，鉴定了脯氨酸特异性转运蛋白，并最终构建了重组菌株，其L-脯氨酸滴度达到前所未有的142.4 g/L——为工业发酵设立了新基准。

转运蛋白工程的应用不限于必需氨基酸。例如，Mohammad等人使用生物信息学工具鉴定Ncgl0580为谷氨酸棒状杆菌中的关键β-丙氨酸输出器，其过表达导致β-丙氨酸产量增加36%。在另一项研究中，Wang等人鉴定RhtA和Gdx为5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）的有效输出器，分别实现产量提高19.9%和25.6%。

除增强氨基酸生物合成外，膜蛋白工程已被应用于提高菌株对高浓度特定代谢物的耐受性。例如，Chen等人将适应性进化与转录组分析相结合，鉴定了参与水杨酸盐耐受的外排蛋白，最终在摇瓶培养中将耐受性提高到3.72 g/L。同样，Liu等人通过过表达YjeH转运蛋白构建了甲硫氨酸生产大肠杆菌菌株，改善了甲硫氨酸耐受性，并在发酵48小时后使产量增加70%。

总之，增强氨基酸特异性转运蛋白的表达或工程化提供了优化微生物生物合成的有力策略。此方法不仅促进高效氨基酸输出，还减轻毒性积累和反馈抑制，从而显著提高生产效率。如在必需和非必需氨基酸以及耐受性工程中所证明，膜蛋白操纵提供了一个多功能工具包，具有大规模生产氨基酸和其他有价值代谢物的巨大潜力。

2.4. 膜蛋白工程有助于减少竞争代谢通量的通量

削弱竞争代谢途径是产氨基酸菌株代谢工程中的关键策略。此方法节省碳资源用于氨基酸生物合成，同时减少副产物形成，从而改善产量和产品纯度。常见策略是阻断导向不需要副产物的分支途径。例如，删除谷氨酸棒状杆菌中的ProB破坏了L-脯氨酸生物合成，从而促进L-精氨酸积累。然而，由于L-脯氨酸是必需营养素，完全阻断其生物合成途径对细胞生长产生负面影响，并限制目标氨基酸的生产。为克服此限制，最近努力已转向靶向副产物的运输途径而非其生物合成路线。消除这些运输系统允许副产物在细胞内积累，其中自然反馈调节抑制其进一步合成。此策略防止过度副产物形成，而不耗尽碳资源或损害细胞生长，从而将代谢通量转向氨基酸生物合成。例如，Huang等人应用通量比较算法和基因组规模代谢网络（GSMN）模型预测提高谷氨酸棒状杆菌中L-精氨酸生产的潜在基因靶点。他们鉴定putP（L-脯氨酸运输）和proC（L-脯氨酸生物合成）为候选靶点。虽然删除proC使L-精氨酸产量增加15.9%（9.94 g/L）并改善葡萄糖转化26.02%，但也导致严重生长抑制。相比之下，删除putP增强L-精氨酸产量42.7%（12.23 g/L）并改善葡萄糖转化49.31%，而不影响生长。这些发现清楚表明，转运蛋白修饰可以比完全途径敲除更有效地将通量重定向到目标氨基酸。同样，Xiao等人检查了谷氨酸棒状杆菌中转运蛋白基因删除对L-赖氨酸生产的影响。破坏gluE、brnE/