基于RPA与PSR等温扩增技术快速检测猪粪便相关RNA病毒（Posavirus）的新型诊断方法开发与评价

《Scientific Reports》：Isothermal nucleic acid amplification assays for the detection of porcine stool-associated RNA virus

本研究针对猪粪便相关RNA病毒（Posavirus）检测中传统方法耗时、依赖实验室设备的问题，开发了重组酶聚合酶扩增（RPA）和聚合酶螺旋反应（PSR）两种等温核酸扩增技术。研究人员通过优化反应条件，实现了对Posavirus polyprotein区域的高特异性检测，灵敏度分别达5.34×106拷贝（RPA）和6.5×103拷贝（PSR），并利用PicoGreen染料实现现场可视化判读。该研究为资源有限地区的猪病毒监测提供了快速、精准的田间诊断工具，对保障生猪健康及畜牧业经济具有重要意义。

　　

在全球畜牧业中，猪作为重要的经济动物，其健康管理直接关系到农业生产与食品安全。然而，猪群常面临多种肠道病毒感染引发的腹泻问题，导致幼猪死亡率上升和生产性能下降。近年来，一类新型病毒——猪粪便相关RNA病毒（Porcine Stool-Associated RNA Virus, Posavirus）逐渐进入研究者视野。该病毒属于Picornavirales目，自2011年在美国腹泻仔猪中首次被发现后，已在多国猪群中检出，但其致病性及流行规律尚不明确。尤其在经济与卫生条件有限的地区，缺乏快速、灵敏的现场检测技术，阻碍了对该病毒的有效监控。

为此，印度Lala Lajpat Rai兽医与动物科学大学的Sarishti Kaushik、Sushila Maan等研究者开展了一项创新性研究，致力于开发两种不依赖精密仪器的等温核酸扩增方法：重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）和聚合酶螺旋反应（Polymerase Spiral Reaction, PSR），用于Posavirus的快速检测。该研究近期发表于《Scientific Reports》，为猪病毒田间监测提供了技术支撑。

关键技术方法概述

研究以印度哈里亚纳邦132份猪粪便及鼻腔拭子（2021年采集）为样本，通过靶向Posavirus多聚蛋白区域设计特异性引物，优化RPA（最佳条件：45°C、20分钟、镁离子浓度16 mM）和PSR（最佳条件：66°C、2.5小时）的反应体系。灵敏度分析采用十倍稀释的质粒标准品，特异性测试涵盖猪肠道病毒G型、猪萨佩罗病毒等常见病原。扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳及PicoGreen染料可视化判读，并与常规PCR对比验证。

研究结果

1. 1.
   assay optimization for RPA assay
   RPA在45°C下反应20分钟时扩增效率最高，镁离子浓度优化至16 mM时信号最强。引物浓度组合为正向0.96 μM、反向0.72 μM时效果最佳。
   
2. 2.
   Optimization of reaction parameters for PSR assay
   PSR在66°C下反应2.5小时达到最优扩增，引物浓度组合为正向4 μM、反向3 μM时灵敏度最高。
   
3. 3.
   Analytical sensitivity of assays
   RPA检测限为5.34×10⁶拷贝（第四稀释度），低于常规PCR（5.34×10²拷贝）；PSR灵敏度达6.5×10³拷贝（第七稀释度），显著优于PCR。使用PicoGreen染料可视化后，RPA和PSR检测限分别提升至53.4拷贝和650.8拷贝。
   
4. 4.
   Analytical specificity of assays
   两种方法均仅对Posavirus产生特异性扩增，与猪圆环病毒、猪细小病毒等常见病原无交叉反应。
   
5. 5.
   Evaluation of developed assays
   对132份田间样本筛查后，仅3份粪便样本呈Posavirus阳性，经测序确认属于Posavirus谱系1，与亚洲及非洲毒株高度同源。

结论与意义

本研究成功建立了RPA与PSR两种等温扩增技术，实现了对Posavirus的快速、高特异性检测。其中PSR灵敏度显著优于常规PCR，且结合染料可视化技术后更适合田间应用。尽管当前印度猪群中Posavirus检出率较低（3/132），但该研究为后续流行病学调查提供了关键工具。这两种方法无需复杂设备，可在资源有限地区推广，对早期预警猪群肠道病毒感染、保障畜牧业可持续发展具有重要实践价值。未来需进一步扩大样本量，明确该病毒与猪腹泻的关联及经济影响。