通过转座子诱变技术探究球形脑细菌（Cereibacter sphaeroides）的核心代谢机制

《Journal of Bacteriology》：Probing the core metabolism of Cereibacter sphaeroides by transposon mutagenesis

该研究通过转座子突变体筛选，揭示了假单胞菌Cereibacter sphaeroides利用3-羟基丙酸的新代谢途径——氧化途径，涉及基因dddC（编码malonate semialdehyde dehydrogenase）和gmor（编码3-羟基丙酸脱氢酶）。同时确认了丙酮酸羧化酶基因pycA在连接C3和C4代谢中间体中的作用，并鉴定了L-谷氨酸钠依赖性TRAP转运蛋白基因rsp_1412和rsp_1413。研究发现3-羟基丙酸通过氧化途径生成乙酰-CoA和CO2，与还原途径形成互补，共同维持氧化还原平衡，减少CO2瞬时产生。

　　Cereibacter sphaeroides 是一种紫色非硫细菌，它在光合作用和氧化磷酸化方面被广泛研究。这种细菌的生长方式具有灵活性，可以利用多种碳源进行光异养生长，同时依赖光作为能量来源。这种特性使其成为研究碳代谢变化的理想模型，因为不同碳源的使用会引发细胞内部代谢路径的调整，从而改变碳流的方向。本文探讨了 C. sphaeroides 在不同碳源利用过程中的代谢变化，特别关注了碳流如何在中心碳代谢中被调控，以维持细胞的红ox平衡和碳平衡。

在光异养条件下，C. sphaeroides 能够使用多种有机碳源，包括3-羟基丙酸、乙酸、L-苹果酸、丙酸/碳酸氢盐、丁酸/碳酸氢盐、L-乳酸、D-乳酸、D-苹果酸、L-谷氨酸等。这些碳源通常只需要少量步骤就能进入中心碳代谢。由于光是能量来源，碳源主要用于细胞碳的合成。这种情况下，光异养生长的碳源会直接转化为细胞所需的碳骨架，而无需进行复杂的氧化过程。然而，在有氧呼吸生长中，碳源不仅作为碳源，还会被部分氧化，释放二氧化碳，并通过电子传递链进行能量合成。这种代谢的灵活性使得 C. sphaeroides 能够适应不同的环境条件，并通过调节碳流来优化生长。

研究中通过随机转座子突变体库筛选，鉴定出一系列 C. sphaeroides 突变体，这些突变体失去了使用某些碳源的能力。这些突变体的发现为理解中心碳代谢中碳流的调控提供了重要线索。例如，通过基因突变实验，确认了丙酸和乙酸之间的代谢路径，揭示了丙酸-CoA羧化酶和乙酸-CoA代谢途径之间的关系。此外，研究还发现3-羟基丙酸可以通过氧化途径转化为乙酰辅酶A和二氧化碳，这一发现挑战了传统的认为3-羟基丙酸只能通过还原途径进入中心碳代谢的假设。

研究结果表明，3-羟基丙酸的代谢路径可能包含两种方式：一种是还原路径，另一种是氧化路径。还原路径涉及将3-羟基丙酸转化为丙酸-CoA，然后通过甲基丙二酰-CoA途径转化为琥珀酰-CoA。而氧化路径则通过3-羟基丙酸脱氢酶和甲烯丙二酰辅酶A脱氢酶的催化作用，将3-羟基丙酸直接转化为乙酰辅酶A和二氧化碳。这一发现表明，乙酰辅酶A可能是一个独立的进入中心碳代谢的途径，与琥珀酰-CoA并行。这种双路径的存在有助于减少代谢过程中暂时产生的二氧化碳和碳酸氢盐，从而维持细胞的红ox平衡。

此外，研究还确认了丙酮酸羧化酶在连接丙酮酸和草酰乙酸池中的作用，以及丙酮酸脱氢酶在连接丙酮酸和乙酰辅酶A池中的作用。这些酶的活性对于不同碳源的代谢至关重要。例如，当使用3-羟基丙酸作为碳源时，丙酮酸脱氢酶的活性可能并不需要，因为3-羟基丙酸可以通过氧化途径直接进入中心碳代谢。这一发现对于理解不同碳源如何影响中心碳代谢具有重要意义。

研究还涉及L-谷氨酸的代谢。L-谷氨酸的运输和代谢可能通过不同的途径进行，其中TRAP转运系统可能在其中起到关键作用。研究中发现，某些L-谷氨酸负突变体的基因插入位置与TRAP转运系统相关，表明这些基因可能编码L-谷氨酸的运输蛋白。此外，L-谷氨酸的代谢可能涉及脱氢酶或脱氨酶，这些酶可能将L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸，进而进入中心碳代谢。这一发现有助于理解L-谷氨酸如何被C. sphaeroides吸收和利用。

通过基因突变和互补实验，研究者还验证了某些基因在代谢过程中的作用。例如，当DddC基因被敲除时，3-羟基丙酸的利用受到显著影响，表明DddC在氧化路径中起关键作用。同样，当Gmor基因被敲除时，L-谷氨酸的利用也受到影响，说明Gmor在代谢过程中可能起到重要作用。这些实验不仅确认了特定基因的功能，还揭示了它们在不同代谢路径中的角色。

研究还涉及多种碳源的运输系统。例如，DctPQM系统可能负责L-苹果酸和琥珀酸的运输，而TRAP系统可能负责L-谷氨酸的运输。这些运输系统的存在和功能对于C. sphaeroides在不同碳源条件下的生长至关重要。此外，某些突变体在没有钠离子的情况下无法有效利用L-谷氨酸，表明钠离子可能在运输过程中起辅助作用。

研究中还发现了一些与光合色素合成相关的突变体，这些突变体在光下无法正常生长。这表明光合色素的合成对于C. sphaeroides的光异养生长至关重要。这些突变体的发现为理解光合色素的合成途径提供了新的视角，并可能对光合机制的研究产生影响。

通过这些研究，我们对C. sphaeroides的中心碳代谢有了更深入的理解。不同碳源的利用路径可能通过不同的酶和转运系统进行调控，而这些调控机制对于维持细胞的红ox平衡和碳平衡至关重要。此外，研究还揭示了某些基因的冗余性，表明在某些情况下，多个路径可能共同作用，以确保代谢的稳定性。

总之，这项研究通过基因突变和互补实验，揭示了C. sphaeroides在不同碳源利用中的代谢机制。这些发现不仅有助于理解中心碳代谢的调控，还可能对其他微生物的碳代谢研究提供参考。此外，研究还强调了代谢路径的灵活性和多样性，这对于微生物适应不同环境条件具有重要意义。