利用DNA条形码技术增强和维持基因编辑造血干细胞的多克隆性研究

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Harnessing DNA barcoding to enhance and sustain polyclonality in gene-edited hematopoietic stem cells

本研究针对基因编辑造血干细胞移植后长期重建能力与克隆多样性维持的难题，开发了携带DNA条形码的AAV6供体模板，建立了可追踪单克隆命运的基因编辑体系。研究发现编辑后造血呈现寡/多克隆模式，并通过优化培养基、添加StemRegenin-1、缩短转导时间等策略，使丙酮酸激酶缺乏症基因编辑效率提升4.5倍，同时维持移植后的多克隆动态平衡，为遗传性血液病的临床治疗提供了重要技术支撑。

　　

在基因治疗领域，通过CRISPR-Cas9介导的同源定向修复实现基因敲入已成为治疗遗传性血液疾病的重要策略。然而，造血干细胞和祖细胞在基因编辑过程中如何兼顾高效编辑与长期植入能力，同时维持克隆多样性，一直是制约临床转化的关键瓶颈。特别是对于丙酮酸激酶缺乏症这类由PKLR基因突变导致红细胞能量代谢异常的罕见病，虽然临床前研究证实基因编辑技术的治疗潜力，但编辑后细胞在体内的克隆动态变化规律仍不明确。

为破解这一难题，Isabel Ojeda-Perez等研究者创新性地将DNA条形码技术整合到基因编辑体系中。研究人员首先构建了携带27bp退化性遗传条形码的AAV6供体模板库，通过高通量测序验证其复杂性后，在健康脐带血来源的CD34⁺细胞中建立编辑体系。有趣的是，尽管体外培养显示高度的条形码多样性，但移植到免疫缺陷NBSGW小鼠后，人类造血主要由少量优势克隆驱动，呈现典型的寡克隆特征。

关键技术方法方面，研究采用CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合体与条形码AAV6供体共递送策略，通过4D核转染系统对造血干细胞进行基因编辑。样本来源包括健康捐赠者脐带血和动员外周血CD34⁺细胞。利用液滴数字PCR精准定量编辑效率，结合新型生物信息学流程分析条形码序列，实现单克隆水平追踪。

开发靶向PKLR基因的条形码AAV6供体模板

研究人员将条形码序列精确插入治疗性转基因的终止密码子与多聚腺苷酸尾之间，构建的文库包含超过400万种理论组合。在MOI（感染复数）2000条件下，56%的集落形成单位显示双端整合成功，且前10个克隆占比低于5%，证明体外培养能维持高度克隆多样性。

条形码供体助力基因编辑方案优化

比较不同培养基发现，StemSpan AOF培养基在维持克隆多样性方面显著优于SCGM培养基，使香农多样性指数达到1.9。通过四组条件对比实验证实，将转导后培养时间从48小时缩短至24小时，结合StemRegenin-1添加和高细胞浓度培养（条件D），能显著提升移植后CD34⁺克隆数量，同时保持约29%的等位基因编辑效率。

化学增强剂对基因编辑的优化作用

在筛选的多种化合物中，DNA-PKcs抑制剂AZD-7648使体外编辑效率提升1.5倍，但与组蛋白去乙酰化抑制剂Trichostatin A联用会导致植入功能严重受损。值得注意的是，AZD处理虽未显著改变CD45⁺群体的克隆多样性，但CD34⁺群体中克隆共享度降低，提示其对原始造血干细胞群存在特异性影响。

讨论与结论

本研究建立的条形码追踪系统首次揭示基因编辑造血干细胞在移植后呈现寡/多克隆动态平衡，与慢病毒载体治疗的克隆复杂性相当。优化后的编辑方案使效率提升4.5倍，同时证明缩短离体培养时间至24小时能更好地保留干细胞活性。特别值得注意的是，CD34⁺群体比CD45⁺群体更能准确反映长期造血重建潜能，这为临床方案优化提供了重要依据。

该研究不仅为丙酮酸激酶缺乏症的基因治疗提供了优化方案，更建立了可推广的基因编辑造血干细胞克隆追踪技术平台。通过DNA条形码技术实现的单克隆分辨率动态监测，为评估基因编辑产品的安全性与有效性设立了新标准，对推进遗传性血液病的临床治疗具有重要指导意义。