用于快速区分苍白密螺旋体（Treponema pallidum）谱系和亚种的循环介导等温扩增检测方法

《Microbiology Spectrum》：Loop-mediated isothermal amplification assays for the rapid discrimination of Treponema pallidum lineages and subspecies

快速区分东亚苍白螺旋体亚种和线系的LAMP淬灭探针法研究。本研究开发并验证了一种基于环介导等温扩增（LAMP）和淬灭探针（QProbes）的新方法，通过检测tp0705和tp0548基因的多态性，快速区分苍白螺旋体pallidum亚种的Nichols、SS14Ω-A、SS14Ω-B 1A和SS14-East Asia线系以及endemicum亚种。在133例日本梅毒患者临床样本中，LAMP方法检测灵敏度为20 DNA拷贝/反应，97%样本（129/133）成功分型，结果与Sanger测序和全基因组测序完全一致。该技术显著降低检测成本（4.11-6.85美元/样本）和时间消耗，为东亚地区梅毒分子流行病学监测提供高效工具。

　　本研究聚焦于一种重要的性传播疾病——梅毒的病原体，即苍白螺旋体（*Treponema pallidum*）的亚种之一，苍白螺旋体亚种苍白亚种（TPA）。梅毒不仅影响个体健康，还对公共卫生构成重大挑战，尤其是在人口流动频繁、性传播疾病高发的地区。由于梅毒在不同人群中传播路径的差异，例如通过性接触或母婴传播，了解其病原体的基因型对于制定有效的防控措施至关重要。近年来，梅毒的发病率在全球范围内上升，特别是在东亚地区，其对胎儿健康和新生儿死亡率的影响尤为显著。此外，梅毒常与其他性传播疾病如艾滋病病毒（HIV）和猴痘病毒共存，进一步增加了疾病的复杂性和防控难度。

在对病原体进行分子监测时，识别其亚种和谱系是关键环节。传统的分子分型方法虽然在准确性方面表现优异，但往往存在耗时、成本高以及对专业设备和技术人员依赖性强等问题。因此，开发一种快速、简便且成本低廉的分型方法显得尤为重要。本研究提出了一种基于环介导等温扩增（LAMP）技术的新型分型方法，结合淬灭探针（QProbes）用于快速区分TPA的主要谱系及苍白螺旋体亚种（TEN）。LAMP技术因其操作简便、反应条件温和、扩增效率高和结果可视性强等优点，已被广泛应用于临床诊断和病原体监测领域。而QProbes的引入则进一步提升了该技术在单核苷酸多态性（SNP）检测中的灵敏度和特异性。

研究团队针对TPA的两个关键基因——*tp0705*和*tp0548*，设计了专门的LAMP分型方案。其中，*tp0705*基因的三个氨基酸位点（506、625和708）存在多种变异形式，这些变异可作为区分不同谱系和亚种的重要依据。*tp0548*基因则具有一个9个碱基对的插入序列，该序列在SS14谱系中存在而在Nichols谱系中缺失，因此可以作为区分这两种谱系的特异性标记。通过结合这两种基因的变异特征，研究团队成功开发出能够区分TPA主要谱系（Nichols、SS14Ω-A、SS14Ω-B 1A和SS14-East Asia）以及TEN的LAMP分型方法。为了验证该方法的可靠性，团队使用了133份来自日本成年梅毒患者的临床样本，包括生殖器拭子和唾液样本。通过对这些样本进行LAMP分型，并与传统的Sanger测序和全基因组测序结果进行对比，发现LAMP方法在129份样本中能够准确识别其基因型、谱系和亚种，仅在4份样本中未能完全分型。这一结果表明，LAMP方法在实际应用中具有较高的准确性和可靠性。

此外，研究团队对LAMP方法的灵敏度进行了评估，发现其对*tp0705*和*tp0548*基因的检测下限为每反应20个DNA拷贝。这一灵敏度水平确保了即使在DNA含量较低的样本中，也能实现有效的病原体识别。通过比较不同样本的DNA拷贝数和LAMP检测结果，团队发现未完全分型的样本中TPA的DNA拷贝数显著低于成功分型的样本。这可能与样本中DNA提取效率或原始DNA含量有关，但LAMP方法仍然能够提供可靠的结果。

在实验设计上，研究团队采用了分阶段检测策略。首先，使用LAMP方法对*tp0705*基因的三个氨基酸位点进行分型，根据检测结果进一步决定是否需要对*tp0548*基因进行分析。如果检测到506T、625M和708G的变异组合，说明该样本可能属于Nichols或SS14Ω-B 1A谱系，此时需要进一步使用针对*tp0548*的LAMP方法进行确认。这种分步检测策略不仅提高了方法的准确性，还减少了不必要的重复实验，从而提升了整体检测效率。

LAMP技术结合QProbes的应用在本研究中展现了其在病原体分子分型中的巨大潜力。与传统的分子分型方法相比，LAMP方法不需要复杂的设备，也不依赖高技能的操作人员，这使其在资源有限的地区或基层医疗机构中具有更强的适用性。同时，LAMP方法的高灵敏度和特异性也使其能够准确识别不同谱系和亚种的病原体，为大规模流行病学研究提供了有力支持。研究团队还通过实验验证了该方法在实际样本中的有效性，结果表明其能够准确区分所有已知的TPA谱系和TEN，且与Sanger测序和全基因组测序结果完全一致。

本研究的结果对于东亚地区的梅毒防控具有重要意义。由于TPA在东亚地区主要以SS14-East Asia谱系为主，该谱系在不同人群中传播的特征可能影响疾病的流行趋势和防控策略。通过快速而准确的分子分型，公共卫生部门可以更及时地掌握疾病传播的动态变化，从而采取针对性的干预措施。此外，LAMP方法的低成本特性也使其在资源有限的地区具有更大的推广价值。相比于传统的多基因位点分型（如MLST）或全基因组测序，LAMP方法不仅能够显著降低检测成本，还能缩短检测时间，这对于大规模筛查和实时监测尤为重要。

从公共卫生角度来看，梅毒的分子分型不仅有助于了解其传播模式，还能为抗药性研究提供重要线索。例如，某些谱系可能对特定抗生素表现出更高的耐药性，而这些信息对于制定合理的治疗方案至关重要。此外，研究团队还提到，通过结合LAMP检测与患者的性别和性取向信息，可以更深入地分析不同人群中的病原体传播特征，从而为精准防控提供数据支持。这种多维度的数据分析方法能够帮助公共卫生机构识别高风险人群，并采取相应的预防和干预措施。

本研究还强调了分子分型在疾病防控中的作用。通过识别不同谱系和亚种的病原体，可以更好地理解疾病的传播路径和流行趋势，从而为公共卫生政策提供科学依据。例如，如果发现某一谱系在特定人群中更为常见，可以针对性地加强该人群的健康教育和筛查频率。同时，分子分型数据也可以用于监测病原体的基因变异情况，为抗药性研究和疫苗开发提供参考。这些数据的积累有助于构建更全面的疾病防控体系，提高公共卫生响应的效率。

此外，本研究的成果也对其他地区具有借鉴意义。虽然目前研究主要集中在东亚地区，但LAMP方法的通用性意味着它可以在全球范围内推广应用。特别是在一些资源有限的地区，传统分子分型方法可能难以实施，而LAMP技术则提供了一种更可行的替代方案。通过这一方法，研究人员可以更快地获取病原体的分子信息，从而为全球梅毒防控工作提供支持。

综上所述，本研究成功开发并验证了一种基于LAMP技术的新型分子分型方法，能够快速、准确且经济地区分TPA的主要谱系和TEN。该方法不仅适用于临床诊断，还为大规模流行病学研究提供了有力工具。随着技术的进一步优化和推广，LAMP结合QProbes的方法有望在未来的公共卫生实践中发挥更大作用，特别是在资源有限的地区，为梅毒的防控提供更加便捷和高效的解决方案。