全基因组关联分析揭示紫花苜蓿耐旱新位点及高通量表型技术应用

《Industrial Crops and Products》：Genome-wide association studies (GWAS) identified novel QTLs for forage yield, stem-leaf and canopy traits of 250 half-sib alfalfa populations grown under Mediterranean conditions

本研究针对地中海气候区干旱胁迫限制苜蓿饲草生产的难题，通过全基因组关联分析（GWAS）结合高通量表型技术，对250个紫花苜蓿半同胞群体进行多性状遗传解析。研究鉴定出与饲草产量（FY）、茎叶性状及冠层特征相关的显著SNP位点，并发现RGB衍生指数（强度、u*）和冠层温度差（CTD）与春季FY显著相关。首次在苜蓿中实现GWAS与遥感表型技术的整合，为耐旱苜蓿育种提供了分子标记和高效表型筛选策略。

　　

在地中海气候区，干旱胁迫正日益成为限制饲草作物生产的关键因素。作为多年生豆科饲草之王，紫花苜蓿（Medicago sativa L.）凭借其深根系和多种耐旱机制，在全球畜牧业中占据重要地位。然而，由于其异花授粉、四倍体遗传特性，苜蓿耐旱性的遗传基础尚未被充分解析。传统表型鉴定方法效率低下，难以满足大规模育种需求。如何突破表型瓶颈，挖掘耐旱遗传位点，成为苜蓿育种亟待解决的难题。

近期发表于《Industrial Crops and Products》的研究，通过整合基因组学与遥感技术，为这一难题提供了创新解决方案。研究团队在智利考克内斯地中海干旱环境中，对250个苜蓿半同胞群体（HSAP）进行了三年度的多性状评估。研究采用基因分型测序（GBS）技术获得高质量SNP标记，结合无人机搭载的RGB和热成像相机获取冠层表型数据，通过全基因组关联分析（GWAS）挖掘与耐旱性状相关的遗传位点。

关键技术方法包括：1）基于α格子设计的田间试验，设置灌溉与雨养两种水分 regime；2）使用无人机遥感平台采集RGB和热成像数据，提取强度、u*等光谱指数及冠层温度差（CTD）；3）GBS测序与Legpipe2流程进行SNP calling，采用四倍体加性模型进行GWAS分析；4）功能注释基于中苜4号参考基因组，通过Medicago truncatula同源基因推断功能。

3.1. 总产量、冬季和春季苜蓿饲草产量

雨养条件下三年平均总饲草产量（FY）较灌溉条件低43%，但冬季FY仅低18%，春季FY低24%。灌溉对总FY的显著提升主要源于夏秋季节的额外收割。2023年降水量增加使灌溉苜蓿FY较2022年提升80.3%，表明水分供应与产量形成密切相关。

3.2. 叶片和冠层性状

茎长、茎粗、茎干重等性状在灌溉条件下显著优于雨养条件。比叶面积（SLA）在灌溉下更高（116.42 cm² g^-1），表明水分充足促进叶面积扩张。茎叶比（SLR）在两种水分 regime 下差异不显著，但基因型间存在丰富变异。

3.3. 高通量表型

RGB衍生指数（强度、u）和CTD与春季FY呈显著负相关（r > -0.55）。强度值在雨养条件下变幅为0.31–0.59，灌溉下为0.29–0.56；u指数在三年间呈现明显年度波动。CTD在雨养条件下与5个SNP显著关联，成为指示水分胁迫的有效指标。

3.4. SNP标记数量及分布特征

经严格过滤（MAF ≥ 5%, phred ≥ 40, MRPL ≥ 40），获得2387–9065个高质量SNP，其中75.6%位于基因区。染色体6虽最长（104.28 Mb），但SNP数量最少，可能与基因组结构复杂性有关。

3.5. SNP-性状关联：饲草产量

灌溉条件下鉴定出7个与总FY显著关联的SNP（Group 2），其中染色体5上5个SNP形成单倍型区块（R²=0.08, q=0.048）。冬季FY关联的3个SNP中，染色体2位点解释表型变异15%（q=0.001）。春季FY在灌溉下关联9个SNP，雨养下仅3个，其中染色体7上SNP4319在多年数据中稳定出现（R²=0.12）。

3.6. SNP-性状关联：茎叶性状

茎干重、叶干重、茎叶比等性状关联SNP数量最多（最高达195个）。叶干重在灌溉下关联169个SNP，雨养下无显著关联；SLA则在雨养下关联33个SNP，揭示不同水分条件下遗传调控机制的差异。

3.7. SNP-性状关联：RGB指数与冠层温度

强度指数在雨养下关联172个SNP，显著多于灌溉条件（14个）。u*指数在雨养下关联93个SNP，灌溉下仅3个。CTD在雨养条件下与5个SNP关联，其中2个位于染色体2，与PsbX蛋白（光系统II组分）和RecA蛋白（DNA修复）相关。

功能注释揭示多个候选基因：染色体2上6030942 bp位点与MsDIUP1（耐旱未知蛋白）同源，过表达可增强拟南芥耐旱性；染色体5上22500564–22500643 bp区域编码推定抗病蛋白，与EDR1基因同源，可能通过水杨酸/乙烯通路调控胁迫响应；染色体4上4721985 bp位点编码O-岩藻糖基转移酶，可能通过DELLA蛋白调控GA信号；染色体2上3878964/3879012 bp位点编码HSP70热激蛋白，在胁迫下维持蛋白质稳态；染色体3上8443183 bp位点编码WRKY转录因子，参与ABA信号导导。

研究首次将遥感表型指标（RGB指数、CTD）与GWAS结合，证明其可作为FY预测的有效替代指标。鉴定出的SNP标记可通过标记辅助选择（MAS）或基因组选择（GS）整合到育种程序，加速耐旱苜蓿品种选育。

该研究建立了苜蓿耐旱遗传解析的新范式，通过多组学整合揭示了关键遗传位点，为应对气候变化下的饲草安全提供了科技支撑。遥感表型技术的成功应用，更为大型育种项目的表型鉴定提供了高效解决方案。未来需进一步验证候选基因功能，并将优势等位基因导入育种群体，最终培育出适应地中海干旱环境的苜蓿新品种。