人促甲状腺激素受体(hTSHR)信号通路体外检测方法的进展与挑战：甲状腺激素系统干扰评估新策略

《Toxicology Letters》：Advances in thyroid hormone system disruption testing – In vitro method for monitoring disrupted thyrotropin signaling through the human TSH receptor (hTSHR)

本文系统介绍了人促甲状腺激素受体(hTSHR)体外检测方法的标准化进程，该方法是欧盟替代动物测试参考实验室(EURL ECVAM)牵头开展的甲状腺干扰物评估体系重要组成部分。作者团队通过优化cAMP信号通路检测方案，建立了可识别促甲状腺激素(TSH)激动剂/拮抗剂的高通量筛选平台，为构建甲状腺激素系统干扰物(TDs)的非动物测试策略提供了关键技术支撑。

　　

研究亮点

测试系统

TSH/cAMP检测方法早在数十年前就已开发，使用的是从亲本CHO（中国仓鼠卵巢）细胞系中分离出的亚克隆。Perret等人（1990年）的原始论文重点介绍了转染hTSHR编码基因的细胞系构建。作者详细描述了24个克隆系的筛选过程，包括它们对TSH刺激的初步反应数据。这些数据记录了细胞在10 mU/ml TSH或1.5 mg/ml甲状腺刺激抗体（TSAb）刺激2小时后的反应情况。

标准化操作程序（SOP）的开发

文献中描述的生物测定程序在多个方法学方面存在很大差异，需要进行标准化。这些方面包括使用未转染的CHO-K细胞作为对照细胞系、选择特定的转染克隆、选择培养基和补充剂、接种密度和培养形式（例如培养皿、96孔板或24孔板）。其他变量还包括洗涤步骤、暴露载体和溶剂、选择和准备参照物（例如促甲状腺激素TSH、弗斯柯林forskolin、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤IBMX）以及cAMP测定方法。培养持续时间、刺激时间、细胞传代次数和冻存细胞的使用也是需要考虑的因素。最终，我们制定了一份详细的SOP，旨在最大限度地提高检测的可靠性和可重复性。

最终SOP与测试材料

标准操作程序（SOP）的最终版本经过EURL ECVAM验证管理组（VMG）的审查和批准。测试材料部分由EURL ECVAM提供，包括参照物/阳性对照、cAMP定量试剂盒、编码化学测试品以及IBMX或弗斯柯林等试剂。

溶解度测定、MTT测定、cAMP测定和NRU测定

表6显示了编码测试品在DMSO或培养基、培养基与DMSO 1:1混合液中的溶解度，储备溶液（HSC）的浓度，在各个测定中测试的最高浓度（HTC），cAMP测定结果以及测试品估算的CV75 / CV70浓度。cAMP产生评估为阴性（N）。

MTT测定——功能测定前测试品的细胞毒性（范围摸索试验）

计算每个复孔的平均光密度（OD）。细胞存活率计算公式为：

$\mathrm{存活率}\left(\%\right)=\frac{\mathrm{测试孔平均OD}}{\mathrm{溶剂对照孔平均OD}}\times 100$

细胞存活率剂量反应测试（MTT测定）

进行此测试是为了确定测试品的浓度，该浓度下细胞存活率至少维持在与未处理的溶剂对照（SC ≥ CV75）和载体对照（VC ≥ CV70）相比的75% / 70%。评估中包含这两个参数是为了评估溶剂的潜在影响。由于两个对照的值非常相似，溶剂的影响被认为可以忽略不计。选择达到≥ CV75存活率阈值的浓度，用于后续的功能测定。这些浓度...

结论

为识别分子、细胞和组织水平上的交叉作用机制而开发的先进非动物体外和计算机模拟工具，为了解甲状腺干扰提供了宝贵贡献。这些有前景的工具旨在识别与人类相关的终点和生物标志物，将方法整合到测试策略中，并有可能将经过验证的方法纳入OECD测试指南（TG）数据库。减少动物测试需求以及体外方法在监管背景下识别甲状腺干扰物（TDs）的适用性，代表了毒理学和安全评估领域的重大进步。我们在此介绍的工作有助于这些更广泛的目标。