基于Luminex的多重免疫分析技术在志贺氏菌疫苗免疫原性评估中的开发与验证

《Vaccine: X》：Development and qualification of a multiplexed immunoassay to assess the immunogenicity of Shigella vaccines

本文报道了一种基于Luminex xMAP技术的多重免疫分析方法，成功整合了五种志贺氏菌血清型（S. sonnei, S. flexneri 1b, 2a, 3a, 6）的LPS、IpaB蛋白及载体蛋白。该研究证实了方法在动态范围（R2≥0.98）、精密度、准确度及特异性方面的优异性能，为多价志贺氏菌疫苗的临床评估提供了标准化、可扩展的解决方案（LLOQ-ULOQ），尤其适用于资源有限地区。

　　

Highlight

方法

志贺氏菌LPS与蛋白抗原：从Walter Reed陆军研究所（WRAIR）获得纯化的S. sonnei、S. flexneri 1b、2a、3a、6的LPS以及志贺氏菌IpaB蛋白。S. sonnei（Moseley株）、S. flexneri 1b（NCTC5株）、S. flexneri 2a（2457T株）、S. flexneri 3a（J17B株）和S. flexneri 6（SSU2415株）的LPS均采用热酚水法提取。

结果

开发用于评估疫苗诱导抗体反应的多重免疫分析需要利用纯化抗原捕获血清抗体，并针对每种抗原设置阳性对照（关键试剂见表1）。为此，我们使用了针对S. sonnei LPS、S. flexneri 1b、2a、3a和6 LPS、IpaB、破伤风类毒素和外毒素A的多克隆小鼠/兔血清，使其与Luminex微球表面的抗原发生反应。通过流式细胞术进行表面分析和抗原监测。

讨论

我们的目标是开发一种基于Luminex的多重分析技术，以同时测量针对多种志贺氏菌疫苗抗原的抗体反应，并建立一个标准化、可转移的平台，该平台具有统一的报告单位，适用于在不同测试点评估多样的疫苗候选物。为实现此目标，我们创建并评估了基于血清的标准品，并评估了关键的分析参数，包括稳定性、线性、重现性和特异性。

志贺氏菌疫苗领域迫切需要能够跨血清型测量抗LPS抗体的标准化免疫分析方法。尽管酶联免疫吸附试验（ELISA）被广泛使用，但实验室间的方法异质性阻碍了研究间的比较。我们开发的多重分析方法解决了这一需求，它能够高效、准确地同时测量针对五种志贺氏菌LPS血清型、IpaB和载体蛋白的抗体反应。

该分析在线性（R² ≥ 0.98）、精密度和准确度方面表现出强劲的性能，满足了所有抗原的预设标准。虽然在高稀释度下，S. flexneri 1b和3a观察到了一些变异，但定量下限（LLOQ）至定量上限（ULOQ）的指定范围每个抗原最多跨越两个数量级。特异性分析显示了对同源抗原的良好识别，其交叉反应模式反映了LPS血清型之间已知的结构相似性。

该平台的另一个关键优势是其可转移性。通过使用标准化的试剂、方案和基于血清的标准品，该分析方法可以在不同实验室之间轻松实施，促进数据比较和协作。这种方法与领域内对协调分析协议和国际血清标准的呼吁高度一致。

结论

这项工作的总体目标是开发一个标准化、稳健的分析平台，用于评估志贺氏菌疫苗候选物的免疫原性。该平台使用协调统一的试剂和方案，可以轻松地在不同实验室间转移，并建立在广泛可用的仪器基础上。此外，它还能适应未来用于量化志贺氏菌特异性抗体的国际标准。