基于10x Genomics平台的新型单细胞新合成转录组测序技术NOTE-seq揭示T细胞活化过程中FLI1调控网络下调

《Cell Reports Methods》：A convenient single-cell assay for the newly synthesized transcriptome reveals FLI1 regulon downregulation during T cell activation

本刊推荐：为解决单细胞新合成转录组测序技术门槛高、通量低的问题，Lyu等人开发了NOTE-seq方法，成功将4-硫尿苷(4sU)标记与10x Genomics平台相结合，实现了常规转录组与新合成转录组的同步检测。应用该技术揭示了T细胞活化过程中FLI1转录因子及其调控网络的关键下调作用，并发现拓扑异构酶抑制剂通过蛋白酶体途径诱导FLI1降解，为癌症化疗免疫副作用机制提供了新见解。

　　

在免疫应答过程中，T细胞的活化涉及复杂的基因表达动态变化，这些变化往往在数小时内迅速发生。然而，传统的单细胞RNA测序技术只能捕捉静态的转录组信息，无法区分新合成的RNA与预先存在的RNA，就像只能看到已经完成的照片而无法观看动态视频一样。这种局限性使得研究人员难以精确解析快速生物学过程中基因表达的时序性调控机制。

虽然计算生物学方法如RNA速度分析试图从已有的测序数据中推断RNA动力学，但这些方法基于一定的假设，可能存在潜在缺陷。而实验方法通过代谢标记新合成RNA，为直接研究转录动态提供了可能。近年来，单细胞新合成转录组测序技术虽有发展，但或因通量有限，或因需要特殊设备和技术专长，限制了其在普通生物学实验室的广泛应用。

针对这一技术瓶颈，美国国立卫生研究院国家癌症研究所的Jun Lyu、Xiaoyan Xu和Chongyi Chen研究团队在《Cell Reports Methods》上发表了研究成果，开发了一种名为NOTE-seq（新合成转录组10x表达测序）的新方法。该方法巧妙地将4-硫尿苷(4sU)标记、硫醇烷基化化学转化与成熟的10x Genomics平台相结合，建立了一个便捷、高效的单细胞双转录组（常规转录组与新合成转录组）分析平台。

NOTE-seq的技术核心包括三个关键步骤：首先使用4sU对新生RNA进行代谢标记；然后通过碘乙酰胺(IAA)进行硫醇特异性烷基化，实现T-to-C（胸腺嘧啶到胞嘧啶）的碱基转换；最后采用经过优化的10x Genomics工作流程，在标准单细胞转录组测序基础上增加了反向交联和第二轮逆转录步骤，以克服甲醛交联对逆转录效率的影响。这种方法不仅保持了10x平台的高通量优势，还使普通生物学实验室无需特殊单细胞技术专长即可进行新合成转录组研究。

研究人员通过多维度实验验证了NOTE-seq的性能。在人类eHAP细胞系中，NOTE-seq与标准10x流程在基因检测数量、转录本计数等方面表现出高度一致性。特别值得注意的是，NOTE-seq显示出极高的T-to-C转换特异性（比其他类型转换高10倍以上），且新合成RNA读数主要富集在内含子区域，这与新转录本的特征完全吻合。对不同转换速率基因（如低转换率的GAPDH和高转换率的MYC）的分析进一步证实了NOTE-seq检测新合成RNA的特异性。

与现有方法相比，NOTE-seq展现出明显优势。与基于甲醇固定的MeOH-4sU-10X方法相比，NOTE-seq检测到更多基因且T-to-C转换率更高；与需要定制微流体平台的scNT-seq相比，NOTE-seq在基因和转录本检测数量上表现更优，其性能与进阶版scNT-seq2nd_SSS相当。这些比较结果表明，NOTE-seq在保持高可及性的同时，提供了优质的新合成转录组检测能力。

应用NOTE-seq解密T细胞活化动态

利用NOTE-seq技术，研究团队深入探究了T细胞活化早期的基因表达动态变化。他们首先在Jurkat T细胞模型中，使用佛波醇12-玛豆酸13-乙酸酯(PMA)和离子霉素(ION)模拟T细胞活化信号，观察刺激后不同时间点的转录组变化。

一个有趣的发现是，基于常规转录组的主成分分析(PCA)无法清晰区分刺激与未刺激的T细胞，而基于新合成转录组的分析则能明显分离这两类细胞。这表明在快速动态过程中，新合成转录组比总转录组更能反映细胞的即时状态变化，因为总RNA中大部分是刺激前存在的RNA，会"稀释"新发生的转录变化。

通过基因调控网络分析，研究人员识别出多个与T细胞活化相关的转录因子调控网络（regulon），包括NF-κB等已知关键通路。差异表达分析不仅确认了CD69等经典T细胞活化标志物的上调，还发现了一些仅在新合成RNA水平才能检测到的变化基因。特别值得注意的是，FLI1转录因子在T细胞活化过程中表现出显著下调，这一现象在常规RNA分析中容易被忽略。

从Jurkat细胞到初始T细胞的验证

考虑到Jurkat细胞系与体内初始T细胞存在差异（如增殖状态、代谢活性等），研究团队进一步在小鼠初始T细胞中验证了NOTE-seq的适用性和FLI1下调的普遍性。

通过时间序列分析（0、2、4、6、8小时），研究发现初始T细胞活化过程中存在明显的转录组进展性变化。基于联合转录组（常规+新合成）的聚类分析能够清晰区分不同时间点的细胞群体，且第一主成分呈现明显的时间梯度变化，反映了基因表达程序的动态演进。

对差异表达转录因子的分析显示，许多上调的转录因子（如Nr4a家族、Egr家族、NF-κB）与Jurkat细胞中的发现一致，而一些下调的转录因子则特异性地在初始T细胞活化中出现，这些因子多与维持细胞静息状态相关，反映了初始T细胞活化特有的"静息退出"过程。

FLI1作为关键调控因子的确认

在初始T细胞活化过程中，FLI1被确认为一个主转录因子，调控着59个下游基因。这些基因大多随时间推移显著下调，使FLI1调控网络成为所有识别出的调控网络中下调最显著的。

基因本体分析显示，FLI1调控网络中的基因富集于T细胞相关生物学过程，表明FLI1在T细胞活化中可能发挥负向调控作用，这与先前关于FLI1抑制T细胞活化和效应T细胞分化的报道相呼应。

拓扑异构酶抑制剂诱导FLI1降解的机制探索

FLI1作为原癌基因，在多种恶性肿瘤中过表达，尤文肉瘤中常见的EWS/FLI1融合蛋白就是典型例子。用于治疗FLI1相关恶性肿瘤的拓扑异构酶抑制剂，如依托泊苷(ETO)和喜树碱(CPT)，被证实能有效抑制FLI1。

研究团队假设这些抑制剂不仅在肿瘤细胞中，在正常T细胞中也可能影响FLI1水平。实验证实，ETO和CPT处理确实导致初始T细胞和Jurkat细胞中FLI1蛋白水平的剂量依赖性降低。这种消耗依赖于拓扑异构酶切割复合物(TOPcc)的形成，因为仅抑制拓扑异构酶催化活性而不形成TOPcc的ICRF-193处理不会引起FLI1减少。

机制研究表明，FLI1消耗并非源于转录抑制（RNA水平无变化），也不是DNA复制和细胞分裂的次级效应（短时间内即可观察到消耗）。有趣的是，伴随FLI1的消耗，拓扑异构酶TOP1和TOP2A也同时减少。进一步实验证明，这种共消耗是蛋白酶体依赖性的，因为蛋白酶体抑制剂能够挽救TOPcc诱导的降解。

基于这些发现，研究提出了一种机制模型：FLI1可能与TOP1、TOP2A形成"拓扑异构体"（topoisome）复合物，当TOPcc形成时，整个复合物通过蛋白酶体途径被协同降解。这一发现揭示了拓扑异构酶靶向化疗药物可能对免疫系统产生的潜在副作用。

研究方法概述

本研究主要采用了NOTE-seq技术平台，结合4-硫尿苷(4sU)代谢标记、硫醇烷基化化学转化和改良的10x Genomics单细胞RNA测序流程。实验系统包括人类Jurkat T细胞系和小鼠初始T细胞（来源于C57BL/6J小鼠脾细胞和淋巴细胞）。技术验证涉及与SLAM-seq、scNT-seq等方法比较，功能验证使用蛋白质印迹、流式细胞术等经典分子生物学技术。

研究结果总结

NOTE-seq技术开发与验证：成功建立了基于10x Genomics平台的新合成转录组测序方法，实现了常规转录组与新合成转录组的同步高通量检测。

T细胞活化动态图谱：应用NOTE-seq揭示了T细胞活化过程中基因表达的时序性变化，发现新合成转录组比总转录组更能反映快速动态过程。

FLI1调控网络的识别：发现FLI1转录因子及其调控网络在T细胞活化早期显著下调，是这一过程中的关键负调控因子。

拓扑异构酶抑制剂的作用机制：揭示ETO和CPT通过形成TOPcc诱导FLI1-TOP1-TOP2A复合物的蛋白酶体降解，阐明了相关化疗药物潜在免疫副作用的分子基础。

结论与意义

本研究开发的NOTE-seq技术为单细胞转录动力学研究提供了强大工具，其与广泛使用的10x Genomics平台的兼容性大大降低了技术门槛，有望推动单细胞新合成转录组测序的普及应用。

在生物学发现层面，研究不仅绘制了T细胞活化过程中基因表达的动态图谱，还识别出FLI1这一关键转录因子在T细胞活化中的重要作用。更重要的是，揭示了拓扑异构酶靶向化疗药物可能通过影响FLI1水平而对免疫系统产生意外影响，这一发现对优化癌症化疗策略、管理免疫相关副作用具有重要启示。

未来研究方向包括将NOTE-seq应用于更多生物系统，深入探究FLI1在免疫调节中的具体功能，以及探索拓扑异构酶抑制剂免疫调节作用的临床意义。这些研究将有助于更全面理解基因表达动态调控在免疫应答和疾病治疗中的作用。