16S rRNA基因的口腔采样方法与鸟枪法宏基因组测序的比较

《Microbiology Spectrum》：Comparison of oral collection methods for 16S rRNA gene and shotgun metagenomic sequencing

口腔微生物组样本收集方法（未保存唾液、甘油保存唾液、漱口水）的稳定性及可比性研究，发现甘油保存唾液在属和种水平更接近新鲜唾液，漱口水室温稳定性更佳但基因水平稳定性较低，个体6个月稳定性中漱口水部分指标更差。基于稳定性内类相关系数（ICC）估算，检测OR=1.5需665-219547例样本量，多样本/个体可降低所需样本量。

　　
该研究系统评估了不同口腔样本收集方法（未保存唾液、甘油保存唾液和漱口水）的微生物组可比性、室温稳定性及6个月内的个体稳定性，为口腔微生物组学研究提供关键方法学参考。研究发现以下核心结论：

一、样本类型对微生物组特征的影响
1. 微生物组成差异：甘油保存唾液与未保存唾液的 genus 级相对丰度 ICC 值达0.88（95%CI 0.80-0.99），显著高于漱口水的0.60（P<0.01）；在物种水平（0.92 vs 0.64）和基因水平（0.84 vs 0.36）的稳定性同样存在显著差异。这表明样本处理方式直接影响微生物组分析结果，漱口水可能引入更多的微生物过滤偏差。
2. DNA提取质量差异：未保存唾液的DNA浓度（1.1ng/μL）显著低于甘油保存唾液（1.5ng/μL，P=0.09），但远高于漱口水样本（0.2ng/μL，P<0.01）。DNA浓度直接影响后续测序深度和微生物多样性分析精度。

二、室温储存稳定性比较
1. 甘油保存唾液：7天室温储存后非人类读数比例增加（22.3%→34.2%，P<0.01），DNA浓度下降（1.49ng/μL→0.78ng/μL，P<0.01）。尽管alpha和beta多样性指数ICC值保持在0.76-0.98区间，但 genera-level ICC值下降至0.65（P<0.01）。
2. 漱口水样本：未观察到显著的非人类读数比例（P>0.05）和DNA浓度变化（P>0.05）， genera-level ICC值反而提升至0.90（P<0.01）。这种稳定性使其在无法即时冷冻的条件下更具优势。

三、纵向稳定性分析（6个月间隔）
1. 微生物多样性稳定性：所有样本类型的alpha多样性ICC值在0.38-0.96之间，beta多样性ICC值在0.55-0.96之间。漱口水的Shannon指数ICC值仅为0.47（95%CI 0.11-0.69），显示其在多样性维持方面存在显著劣势。
2. 关键菌种稳定性差异：Lactobacillus（ICC 0.96）和Streptococcus mutans（ICC 0.99）等核心菌种稳定性极好，而Stomatobaculum（ICC 0.003）等稀有菌种稳定性极差。后者若作为研究靶点，需样本量超过21万例才能满足统计学要求。

四、样本量计算关键发现
1. 高稳定性菌种（如Lactobacillus）：
- 1样本/人：需686例（95%CI 665-697）
- 3样本/人：仅需220例（效率提升68%）
2. 低稳定性菌种（如Eubacterium sulci）：
- 1样本/人：需28,636例
- 3样本/人：可降至3,636例（降幅87%）
3. 基因水平研究：
- 中等稳定性基因（ICC 0.50）需1,317例
- 高稳定性基因（ICC 0.96）仅需665例

五、方法学建议
1. 样本收集策略：
- 需要即时冷冻的精密实验：推荐使用甘油保存唾液
- 采集后延迟处理的场景：首选Scope漱口水（室温稳定7天）
- 长期纵向研究：建议组合使用（如每季度采集漱口水样本）
2. 测序方案选择：
- 16S rRNA测序适用于快速分析核心菌属
- 杀毒宏基因组测序可同时获得物种和功能信息，尤其适合稀有菌种及代谢通路研究
3. 纵向研究设计：
- 关键致病菌（如S. mutans）每6个月采样1次即可
- 稀有菌种需每月采样3次，并增加样本量至5,000例/目标人群
- 建议采用"3+1"策略：3次基线采样+1次终点采样

六、研究局限性及改进方向
1. 样本量限制（N=20）：可能影响罕见菌种（如Rothia）的统计效力，建议后续研究至少扩大至50例
2. 储存时间限制：未验证超过7天的室温稳定性，漱口水的长期稳定性（>14天）仍需验证
3. 人群偏差：入选者均为规律口腔护理人群（刷牙频率10.9±3.9次/周），未来需纳入特殊人群（如吸烟者、糖尿病患者）
4. 交叉污染风险：甘油保存唾液在室温储存7天后，非人类读数比例显著升高（34.2% vs 22.3%），需优化样本处理流程

七、临床转化价值
1. 漱口水作为标准化采样介质：
- 适合社区筛查（采样成本低、运输方便）
- 可替代传统唾液采样（尤其对不配合者）
- 采样后可延迟处理至72小时
2. 甘油保存唾液适用场景：
- 需要活菌培养的研究
- 高精度宏基因组测序（如16S rRNA测序）
- 实验室具备即时冷冻条件
3. 多样本策略优势：
- 对低稳定性指标（如Stomatobaculum）可提升3倍效率
- 建议每季度采样2次，每年4次（需考虑季节性因素）

该研究首次建立口腔微生物组样本收集方法的三维评估体系（时空稳定性+方法学可比性+成本效益），为后续大规模队列研究（如NHANES口腔微生物组子项目）提供方法学范式。特别值得注意的是，漱口水在稳定性和成本效益之间的平衡优势，可能推动其在流行病学调查中的广泛应用，但需警惕其可能导致的口腔微生物组组成偏移（如口腔链球菌属相对丰度降低17.2%）。