土壤真菌菌丝半自动化分离技术的革新：SSC方法在自然基质中的应用与微生物互作研究

《Journal of Experimental Botany》：Streamlining the isolation of fungal hyphae: A semi-automated approach for soil substrates

本刊编辑推荐：针对从自然土壤中高效提取真菌菌丝及其附着微生物的难题，研究人员开发了一种半自动化的筛分与蔗糖离心(SSC)技术。该方法结合了湿筛分与密度梯度离心步骤，避免了传统方法中沙土或玻璃珠添加带来的人工干扰，将处理时间缩短了2.5倍，并显著降低了操作者依赖性变异。研究证实SSC方法不仅能准确量化菌丝长度密度(HLD)，还能保持菌丝表面微生物的完整性，为研究真菌-细菌互作提供了可靠工具。

　　

在复杂的土壤生态系统中，真菌菌丝如同地下的神经网络，穿梭于土壤颗粒之间，形成庞大的菌丝网络。这些直径通常只有2-20微米的丝状结构不仅是真菌吸收养分和繁殖的主要器官，更是土壤中微生物互作的热点区域。菌丝表面附着的大量细菌群落与真菌形成复杂的共生关系，共同参与养分循环、有机物分解等关键生态过程。然而，要从自然土壤中分离出完整的真菌菌丝并保持其表面微生物群落的完整性，一直是困扰研究人员的技术瓶颈。

传统方法如湿筛分法(BSM)和水/蔗糖离心法(WSCM)存在明显局限性：前者在粘性土壤中易堵塞滤膜，后者处理时间长达40分钟且使用的焦磷酸钠会抑制DNA扩增。更棘手的是，许多研究为了简化操作而在土壤中添加沙土或玻璃珠，这种人为干预改变了土壤的自然结构，可能影响微生物的真实分布和功能。此外，手工操作步骤带来的变异性和低通量问题，也限制了大尺度田间研究的可行性。

针对这些挑战，德国科隆大学植物科学研究所的Isabelle Elisabeth Metzen和Marcel Bucher研究团队在《Journal of Experimental Botany》上发表了一项创新研究，开发了一种名为"筛分与蔗糖离心(SSC)"的半自动化方法，实现了从自然土壤中高效提取真菌菌丝并保持附着微生物完整性的突破。

研究人员采用的关键技术方法主要包括：使用Retsch AS 200 Basic湿筛分仪进行自动化筛分（设置参数为2.5巴水压和75%振幅），通过630μm、400μm、315μm和40μm系列筛网逐步分离；采用70%蔗糖密度梯度离心（2000 rpm，10分钟，4°C）纯化菌丝；结合视觉网格线相交法(VGI)进行菌丝长度密度(HLD)量化；利用扫描电镜(SEM)、DAPI染色和分子技术验证微生物附着；通过对田间样本（2019-2021年科隆大学试验站的不同施肥处理小区）进行ITS2和16S V4区域扩增子测序，分析菌丝面、菌丝圈和本体土壤的微生物群落差异。

方法开发与优化

研究团队通过系统优化发现，振幅高于75%结合3.0巴水压会导致孢子完全损坏和18%的菌丝损伤，最终确定2.5巴水压和75%振幅为最佳参数。与传统方法相比，SSC方法将样品处理时间从WSCM的4.7小时缩短至2.2小时，效率提高2倍以上。方法比较显示，SSC提取的菌丝长度密度显著高于BSM和WSCM方法。

菌丝长度量化方法比较

研究人员评估了两种半自动化菌丝长度量化工具（AnaMorf和HyLength）与手动VGI法的准确性。结果显示，在完整样品中，AnaMorf的平均绝对误差(MAE)高达3350.84厘米，平均百分比误差(MPE)为228.44%，而HyLength的误差较小（MAE 1830.74厘米，MPE 118.02%）。VGI法在不同样品量（全量、半量和四分之一量）中均表现出最佳的准确性和可扩展性，被确定为最可靠的菌丝长度量化方法。

田间样品中菌丝分布与相关性

通过分析菌丝容器中六个不同位置的样品，研究发现菌丝分布均匀，这对于使用子样品进行研究至关重要。菌丝长度密度与玉米根系细胞内菌根定殖强度呈正相关（R=0.5-0.8），特别是与含有细胞内菌丝和丛枝的阶段相关性最强，表明菌根共生活跃期与外部菌丝生长密切相关。

菌丝面真菌群落特征

SSC方法成功地从高度多样的田间真菌群落中富集了菌丝，以子囊菌门(Ascomycota)和极小水母菌属(Minimedusa)、瓶霉属(Phialophora)为主导。值得注意的是，机械筛分可能对较粗的菌丝（如担子菌门）有富集作用，而较细的菌丝（如被孢霉门）可能在此过程中损失。

细菌附着与菌丝面细菌群落

扫描电镜、PCR和DAPI染色证实，SSC方法处理后细菌仍附着在真菌菌丝上。菌丝面细菌群落以变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteriota)为主，其中酸杆菌属(Acidibacter)和黄杆菌属(Flavobacterium)为最丰富的类群。

不同区室微生物群落差异

主坐标分析(PCoA)显示，菌丝面真菌和细菌群落与本体土壤和菌丝圈群落明显不同，而本体土壤和菌丝圈群落则有较大重叠。菌丝面与本体土壤共享22%的真菌ASVs（扩增子序列变体），共享55%的细菌ASVs，表明SSC方法成功富集了与菌丝紧密相关的微生物。

研究结论表明，SSC方法通过优化和自动化湿筛分步骤，实现了从自然基质中高效提取菌丝的突破，比传统方法快2-2.5倍，并显著降低了操作者依赖性变异。该方法避免了沙土或玻璃珠添加，保持了自然的植物-土壤-微生物连续性，为在田间尺度上研究菌丝面微生物群落如何响应土壤管理和植物基因型提供了有力工具。

该研究的创新之处在于首次系统评估并优化了菌丝提取过程中微生物附着的保持情况，建立了标准化、高通量的工作流程。未来研究可进一步探索不同土壤类型和植物物种中菌丝面微生物群落的功能特征，以及这些群落对生态系统过程的贡献。随着菌丝面微生物研究的深入，SSC方法有望成为土壤微生物生态学研究的重要工具，推动我们对地下真菌-细菌互作网络的理解。