通过结构导向的蛋白质工程和可视化的高通量筛选方法提高l-苏氨酸转醛醇酶的活性及Cβ-立体选择性

《ACS Sustainable Chemistry & Engineering》：Improving Activity and Cβ-Stereoselectivity of l-Threonine Transaldolase via Structure-Guided Protein Engineering and a Visual High-Throughput Screening Method

β-羟基-α-氨基酸不对称合成、LTTA11酶工程、定向进化、立体选择性、高通量筛选、M3突变体、酶活性优化、工业制备、脱氢酶、底物适应性

　　
β-羟基-α-氨基酸作为天然产物和药物分子的重要构建单元，其不对称合成在化学工业中具有战略意义。传统化学合成方法常面临立体控制困难、纯化成本高及反应条件严苛等问题，而生物催化技术凭借其温和条件、高选择性和可进化性成为替代方案。其中，L-苏氨酸转醛酶（LTTA）因其能同时控制α和β碳的立体化学，成为研究热点。本文聚焦于LTTA11的定向进化研究，通过创新的高通量筛选策略和组合突变技术，成功开发出具有工业应用潜力的酶变体M3。

研究团队首先构建了基于乙醛脱氢酶（FLS）的显色高通量筛选体系。当LTTA催化反应生成副产物乙醛时，通过耦合FLS将其转化为显色产物3-羟基-2-丁酮，利用分光光度法实现酶活性的快速可视化检测。该创新方法突破了传统依赖HPLC分析的局限性，将筛选效率提升约10倍，显著加速了酶工程进程。

在定向进化过程中，研究团队采用"双阶段饱和突变"策略。第一阶段对活性口袋周边的41个氨基酸位点进行饱和突变，筛选出F59G/M65N/F70T组合具有最佳性能。第二阶段针对关键突变位点（F59、M65、F70）进行迭代饱和突变，最终M3变体实现活性提升160倍（达486.3%相对活性），对映体过量值（de值）达到97.3%，创酶催化领域新纪录。

酶学性能优化方面，M3变体展现出显著的热稳定性（Tm值73.7℃）和底物适应性。其动力学参数显示：Km（苏氨酸）为17.6 mM，kcat为13.35 s?1，Km（底物1a）仅0.07 mM，kcat达2.1倍野生型。特别在制备关键药物中间体L-苏硫酰-4-甲基苯基丝氨酸（MTPS）时，M3在500 mM底物浓度下仍保持99%的de值和95.1%的产率，空间时间产率达20 g L?1 h?1，较现有报道提升近3倍。

工业应用验证阶段，研究团队采用200 L连续搅拌釜进行放大实验。在1000 mM底物浓度下，M3仍能维持96.7%的de值和29.1%的产率，成功实现4-硝基苯基丝氨酸的百克级制备。通过正交结晶纯化工艺，最终产品纯度达99%，分离产率提升至67.6%，为工业化生产提供了技术范式。

该研究突破性进展体现在三个维度：首先，开发出首套基于副产物监测的LTTA高通量筛选平台，将突变体筛选周期从3个月压缩至2周；其次，建立"口袋优化-通道调控"协同进化模型，通过F59G（口袋溶剂化）与F70T（通道疏水）的协同作用，实现活性与稳定性的双重提升；最后，首创"梯度底物加载-动态pH调控"工艺，在1000 mM底物浓度下仍保持97%的立体选择性，为高浓度生物催化提供了新解决方案。

未来研究将聚焦于：1）开发模块化高通量筛选平台，兼容不同LTTA家族成员；2）构建基于机器学习的理性设计体系，优化酶-底物互作界面；3）探索固定化细胞膜反应器，实现连续化生产。这些技术突破有望将β-羟基-α-氨基酸的生物催化成本降低至化学合成方法的1/5，推动绿色制药产业升级。