《Journal of Biosafety and Biosecurity》：Establishment of a simple and novel method for contact-dependent intercellular interaction analysis using extracellular vesicles
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外泌体（EVs）作为膜结合囊泡，在细胞间通讯和生理过程中起关键作用。本研究开发了一种基于EVs的新方法，通过荧光标记EVs表面呈现特定抗原（如脑钠肽前体或IL-2受体），利用流式细胞术定量检测与杂交瘤细胞受体的特异性结合，简化了复杂细胞相互作用的分析流程，为生物医学研究提供高效工具。
佐上里奈（Rina Sakamaki）| 松叶隆夫（Takao Matsuba）| 栗原康之（Yasuyuki Kurihara）
日本横滨国立大学工学研究生院分子生物学实验室，日本横滨市保土谷区常磐台240-8501
细胞外囊泡（EVs），包括外泌体（exosomes）、微囊泡（microvesicles）和凋亡小体（apoptotic bodies），是由细胞分泌的膜包裹的囊泡。它们在细胞间通讯中发挥着重要作用，并参与众多生理过程。鉴于其功能重要性，EVs已成为诊断和治疗各种疾病的潜在工具。在本研究中，我们重点探讨了EVs的实用性，并探索了它们在分析细胞间接触依赖性相互作用（contact-dependent cell–cell interactions）中的应用，这些相互作用对于控制细胞分化和诱导免疫反应至关重要。尽管已经开发出多种方法来评估这些相互作用，但它们通常需要复杂的程序和高级优化，从而限制了其广泛应用。为了克服这些限制，我们开发了一种新的方法，利用EVs以天然构象呈现膜蛋白。我们的策略包括制备带有目标抗原的荧光标记EVs，并通过流式细胞术（flow cytometry）定量评估它们与目标细胞的结合情况。使用带有N端脑利钠肽（pro-brain natriuretic peptide）或白细胞介素-2受体（interleukin-2 receptor）的荧光标记EVs，我们成功检测到了与相应杂交瘤B细胞受体的特异性相互作用。这种更简单的方法无需高级优化，能够在生理条件下高效、定量地分析细胞间相互作用。我们的发现凸显了这种基于EV的系统作为生物科学研究中研究膜蛋白介导的细胞间相互作用的宝贵工具的潜力。
部分内容摘录
质粒载体构建
为了构建质粒载体，我们从pBApo-CMV Neo DNA载体（Takara Bio Inc., 日本滋贺县）中扩增了CMV启动子区域，使用KOD One PCR Master Mix（Toyobo Co., Ltd., 日本大阪）进行扩增，并将其作为载体骨架。GFP基因序列（对应于GenBank数据库条目BAL60529中的氨基酸残基1–267）也使用KOD One PCR Master Mix和与线性化载体末端同源的引物进行了扩增。
实验概念
为了分析细胞间接触依赖性相互作用，我们使用抗原呈递EVs和产生抗体的杂交瘤细胞构建了一个模型系统。该模型旨在评估携带配体的EVs与细胞膜上受体之间的结合。流式细胞术（FCM）被选为主要分析工具，因为它非常适合在单细胞水平上检测EV–细胞相互作用。FCM分析需要对EVs进行荧光标记，并确保配体在细胞表面的稳定呈现。
讨论
在本研究中，我们开发了一种利用EVs分析接触依赖性相互作用的新方法，并以BCR（B细胞受体）与膜蛋白之间的相互作用作为模型。首先，我们建立了一种生成膜上呈现抗原的荧光标记EVs的简单方案；这些EVs是该方法的关键。两种不同类型的抗原（一种肽和一种膜蛋白）分别被呈递在EVs上，并与相应的杂交瘤细胞孵育。
CRediT作者贡献声明
佐上里奈（Rina Sakamaki）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，实验设计，数据管理，概念构建。松叶隆夫（Takao Matsuba）：监督，实验设计。栗原康之（Yasuyuki Kurihara）：撰写 – 审稿与编辑，监督，数据管理，概念构建。
致谢
本研究未获得任何公共部门、商业机构或非营利组织的特定资助。
