工程化纳米抗体TR-FRET技术首次揭示内源性CXCR4寡聚体的生理存在

《Communications Biology》：TR-FRET between engineered nanobodies reveals the existence of endogenous CXCR4 oligomers

本研究针对GPCR寡聚体在生理环境下证据缺失的难题，开发了基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的纳米抗体检测新方法。通过位点特异性标记的CXCR4/ACKR3纳米抗体，首次在非转染的癌细胞系及外周血单核细胞中证实内源性CXCR4同源寡聚体的存在，为GPCR寡聚化生理功能研究提供关键技术支撑。

　　

在细胞通信的复杂网络中，G蛋白偶联受体（GPCR）作为最大的细胞表面受体家族，犹如精准的分子开关调控着生理与病理过程。然而长期以来，关于GPCR是否以寡聚体形式发挥功能存在激烈争议——尤其在天然环境下，由于缺乏合适的检测工具，直接证据始终悬而未决。趋化因子受体CXCR4与其 atypical 受体ACKR3（原名CXCR7）的相互作用网络在免疫调节和癌症发展中扮演着关键角色，但它们的寡聚化现象是否存在于真实生理环境，一直是领域内亟待破解的谜题。

传统技术如荧光蛋白融合标记会干扰受体天然状态，而常规抗体因分子尺寸过大可能导致假阳性信号。正是为了突破这一技术瓶颈，法国蒙彼利埃大学与荷兰阿姆斯特丹自由大学联合团队在《Communications Biology》发表了创新性研究成果，开发出基于工程化纳米抗体的TR-FRET检测新策略。

研究团队采用的核心技术包括：1）通过噬菌体展示技术筛选获得高亲和力CXCR4/ACKR3纳米抗体；2）利用金黄色葡萄球菌分选酶A（sortase A）进行位点特异性荧光标记，确保纳米抗体活性不受影响；3）建立TR-FRET结合实验与显微成像系统，实现从分子到细胞水平的寡聚体检测；4）应用流式细胞术验证受体表达水平；5）使用人外周血单核细胞（PBMC）等天然样本进行验证。

CXCR4-和ACKR3特异性纳米抗体不影响其靶受体的寡聚化

研究人员首先验证了所选纳米抗体VUN400（靶向CXCR4）和VUN700（靶向ACKR3）本身不诱导受体寡聚化状态改变。通过BRET实验证实，与天然配体CXCL12不同，纳米抗体结合后不会引起受体构象重排，表明它们适合用于天然条件下的寡聚体研究。

分选酶介导的荧光标记保持纳米抗体的高结合亲和力

为避免传统随机标记导致的活性损失，团队开发了分选酶介导的位点特异性标记方法。荧光标记后的纳米抗体保持了纳摩尔级的高亲和力（VUN400-Lumi4-Tb对Halo-CXCR4的K_d为2.0 nM），且表现出优异的选择性，无交叉反应。

标记的VUN400和VUN700支持在转染的CHO-K1细胞中检测CXCR4和ACKR3寡聚体

在过表达模型中，TR-FRET信号呈现饱和曲线特征，且竞争实验显示典型的钟形曲线，证明信号特异性来源于受体寡聚化。通过调节受体密度实验排除了随机碰撞产生的动态FRET可能性，进一步确认了CXCR4同源寡聚体的存在。

使用标记的VUN400和VUN700在转染的HEK293T细胞中通过TR-FRET显微镜检测CXCR4和ACKR3寡聚体

TR-FRET显微镜可视化显示CXCR4寡聚体主要定位于细胞膜，而ACKR3则因组成性内化呈现点状细胞内分布。共表达实验成功检测到CXCR4-ACKR3异源寡聚体，且截断内化域的ACKR3-ΔCterm突变体在膜表面表现出更强的TR-FRET信号。

在人细胞系中检测内源性CXCR4寡聚体

研究在Raji、Jurkat和CCRF-CEM等内源性高表达CXCR4的白血病/淋巴瘤细胞系中成功检测到特异性TR-FRET信号（R²>0.9），而在低表达CXCR4的THP-1和HEK293T细胞中则未检测到明显信号。这表明内源性CXCR4寡聚体的检测灵敏度与受体表达水平密切相关。

在人PBMC中检测内源性CXCR4寡聚体

最令人振奋的发现来自对外周血单核细胞的研究——在天然生理环境下明确检测到CXCR4寡聚体的存在（p<0.0001）。这一发现彻底改变了认为GPCR寡聚体仅是过表达系统产物的传统观点。

本研究通过创新性的纳米抗体TR-FRET技术体系，首次提供了内源性CXCR4寡聚体在生理环境下存在的直接证据。这一突破不仅解决了GPCR寡聚化研究领域长期存在的技术难题，更建立了可推广至其他膜蛋白研究的通用平台。值得注意的是，CXCR4寡聚体在癌细胞与正常免疫细胞中的共同存在，提示其可能具有超越病理状态的普遍生理功能。该技术为在天然环境下研究GPCR超分子组织及其在疾病中的作用开辟了新途径，对精准靶向受体寡聚体的药物开发具有重大意义。