基于GP96融合策略的替代性抗原滞留技术诱导小鼠长效广谱免疫应答

《Nature Communications》：Alternative antigen retention by a gp96-fusion approach induces long-lasting and broad immunity in mice

为应对SARS-CoV-2和HPV等病毒变异导致的疫苗交叉保护不足及抗体应答短暂等挑战，程芳等研究人员开展了基于热休克蛋白GP96的抗原融合疫苗研究。该研究将病毒抗原（如SARS-CoV-2 RBD、HPV L1/E7）与GP96的N端融合，形成稳定二聚体，可显著增强抗原在滤泡树突状细胞（FDC）表面的滞留（通过LRP1/CD91受体结合），并促进树突状细胞（DC）抗原呈递，从而诱导强效、持久的中和抗体、生发中心B细胞应答及交叉保守的T细胞免疫。该策略为开发广谱长效疫苗提供了新平台。

　　

新冠病毒（SARS-CoV-2）和人类乳头瘤病毒（HPV）等病原体不断变异，给疫苗研发带来巨大挑战。现有疫苗往往面临抗体反应持续时间短、交叉保护能力有限，以及难以有效激活T细胞免疫等问题。尤其是面对快速进化的病毒，如何通过疫苗设计同时激发强大且持久的B细胞和T细胞免疫，成为当前疫苗学领域的核心难题。在这一背景下，热休克蛋白GP96（GRP94）因其独特的免疫佐剂特性引起了研究人员的关注。GP96是内质网中的一种分子伴侣，能够通过结合CD91（LRP1）和Toll样受体（TLR）激活树突状细胞，并促进抗原的交叉呈递，从而增强T细胞应答。然而，GP96在天然状态下与较大分子量抗原的结合模式不明确，且其促进B细胞应答的能力相对较弱，限制了其作为疫苗佐剂的广泛应用。为了解决这些问题，并开发一种能诱导全面、持久免疫的新型疫苗平台，程芳、王百峰、朱欣然等研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：利用AlphaFold3和分子动力学模拟进行抗原-GP96融合蛋白的结构预测与稳定性分析；通过杆状病毒表达系统制备并纯化重组蛋白（如RBD-GP96-Fusion、L1-GP96-Fusion）；采用表面等离子共振（SPR）、分析型超速离心和透射电子显微镜（TEM）进行蛋白理化性质表征；通过小鼠模型（包括BALB/c、C57BL/6、hACE2转基因鼠和HLA-A2转基因鼠）进行免疫原性评估；利用流式细胞术、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和ELISPOT等技术深度解析免疫细胞应答；并建立了SARS-CoV-2病毒攻毒模型和HeLa异种移植瘤模型以评估疫苗保护效果。

结构引导的 dimeric RBD-GP96-Fusion 设计成为优越的免疫原

研究人员首先利用AlphaFold3对多种病毒抗原与GP96的结合模式进行了大规模筛选。结果显示，这些抗原（如SARS-CoV-2 RBD、流感HA1、HPV L1等）主要倾向于结合GP96的N端结构域（NTD）。因此，他们将抗原（如RBD的C端G545残基）与GP96的N端D22残基连接，构建了RBD-GP96-Fusion蛋白。分子动力学模拟表明，该融合蛋白的二聚体结构比单独的GP96二聚体更稳定。实验证实，RBD-GP96-Fusion能形成稳定的二聚体（约231 kDa），其受体结合基序（RBM）完全暴露，与hACE2的结合亲和力与RBD二聚体相当。更重要的是，RBD-GP96-Fusion具有更高的热稳定性和抗胰蛋白酶水解能力，并且在体内注射部位和引流淋巴结中的滞留时间显著延长，起到了类似缓释库的作用。

RBD-GP96-Fusion疫苗通过激活GC B细胞反应促进有效中和抗体的产生

在小鼠免疫实验中，与铝佐剂（alum）或单独GP96佐剂相比，RBD-GP96-Fusion诱导了显著更高水平的抗原特异性IgG及其亚类（IgG1、IgG2a、IgG2b）和IgM，且抗体滴度在免疫6个月后仍维持在高水平。该疫苗还能诱导强烈的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性，并对多种SARS-CoV-2变异株（如Omicron BA.1）产生交叉中和抗体。在hACE2转基因小鼠的病毒攻毒实验中，RBD-GP96-Fusion免疫组表现出更低的肺部病毒载量和更轻的病理损伤。scRNA-seq和流式细胞术分析表明，RBD-GP96-Fusion能显著富集于生发中心（GC）B细胞，并诱导更高频率和数量的GC B细胞和抗原特异性记忆B细胞（MBC）前体，这些反应与长效体液免疫密切相关。

RBD-GP96-Fusion疫苗通过FDC上的LPR1产生替代性抗原滞留途径，持续激活GC B细胞

机制研究表明，RBD-GP96-Fusion能通过其GP96结构域与滤泡树突状细胞（FDC）表面的LRP1/CD91受体结合，从而在FDC表面大量滞留抗原。这种滞留不依赖于经典的Fc受体（FcR）或补体受体（CR2/CR1）途径。阻断LRP1会显著减少RBD-GP96-Fusion与FDC的结合，并降低免疫后的抗体滴度。体外共培养实验进一步证实，RBD-GP96-Fusion处理的FDC能与GC B细胞发生更长时间的相互作用，且该作用可被LRP1抗体阻断。这揭示了一条新的抗原呈递途径：GP96-LRP1相互作用增强了抗原在GC中的滞留，从而为B细胞提供了持续的激活信号。

RBD-GP96-Fusion疫苗通过靶向DC诱导广泛且持久的T细胞应答

在细胞免疫方面，RBD-GP96-Fusion免疫后，小鼠脾脏和支气管肺泡灌洗液（BALF）中产生了更强的抗原特异性CD8⁺T细胞应答，特别是分泌IFN-γ的效应T细胞。该疫苗还能诱导肺组织定居记忆T细胞（T_RM）和表达归巢分子（如CXCR6、α4β7）的T细胞，表明其能激发肺部黏膜免疫。机制上，RBD-GP96-Fusion能通过GP96与树突状细胞（DC）表面的CD91/LRP1结合，被DC高效内化，并经由内体-溶酶体或蛋白酶体途径水解，最终将抗原肽递呈至内质网，进行MHC I类分子交叉呈递，从而激活CD8⁺T细胞。

通过融合策略构建的HPV疫苗诱导有效的抗体、细胞免疫应答和病毒清除能力

为了验证GP96融合策略的普适性，研究人员还构建了HPV-18 L1-GP96-Fusion和E7-GP96-Fusion疫苗。L1-GP96-Fusion能诱导高滴度的L1特异性抗体和强烈的GC B细胞反应。更重要的是，E7-GP96-Fusion能激发强大的效应CD8⁺T细胞免疫（产生IFN-γ、Granzyme B、Perforin等细胞因子）。在HeLa荷瘤小鼠模型中，过继转移E7-GP96-Fusion免疫小鼠的CD8⁺T细胞能显著抑制肿瘤生长，并促进CD8⁺T细胞向肿瘤组织浸润，展现了其抗肿瘤潜力。

该研究成功开发了一种基于GP96 N端融合的新型疫苗平台。该平台通过将抗原与GP96融合，形成了稳定的二聚体纳米颗粒，不仅增强了抗原的稳定性，更重要的是，通过GP96与FDC表面的LRP1/CD91受体结合，创造了一种替代性的抗原滞留机制，显著延长了抗原在淋巴组织生发中心的停留时间，从而持续激活B细胞，诱导强效、持久且广谱的体液免疫。同时，该策略也能高效靶向DC，促进抗原的交叉呈递，激发强大的T细胞免疫，尤其是细胞毒性T细胞应答。研究在SARS-CoV-2和HPV两种重要病原体模型中均验证了该策略的有效性，证明了其作为通用疫苗平台的巨大潜力。这种创新设计为应对快速变异病毒和开发治疗性疫苗（如抗肿瘤疫苗）提供了新的思路和强有力的工具。