单细胞表型分析和测序技术揭示了在嗜热发酵过程中具有代谢活性的低丰度酵母

《Bioresource Technology》：Single-cell phenotyping and sequencing uncover metabolically active low-abundance yeasts in thermophilic fermentation

微生物驱动发酵过程中高温老曲（HTD）的菌群动态与代谢活性解耦机制研究。通过整合单细胞拉曼光谱激活细胞分选（RACS）技术、基因组测序与合成菌群发酵实验，揭示 HTD 发酵中仅 10-32% 测序酵母具有代谢活性，并鉴定出 Pichia kudriavzevii、Wickerhamomyces anomalus 和 Saccharomycopsis fibuligera 三种关键功能菌株。基因组分析表明 P. kudriavzevii 具有独特的耐热基因（wos2 和 FLO8）扩张，使其在 45℃ 以上高温阶段保持代谢优势，主导乙醇生产并实现菌群数量主导。研究建立了单细胞代谢活力与宏基因组时空联动的分析方法，为复杂微生物系统功能解析提供新范式。

　　
本研究以中国高温型酒曲（HTD）为模型系统，通过整合元基因组学与单细胞拉曼光谱技术，揭示了极端温度下微生物群落代谢活性的动态特征及其生态功能机制。研究团队发现，在持续40天的HTD发酵过程中，随着温度从25℃逐步提升至60℃并经历三阶段生物热循环，传统宏基因组学方法检测到的酵母物种中仅有10-32%表现出实际代谢活性，这种显著的物种组成与功能状态脱耦现象对理解复杂微生物生态系统调控具有重要启示。

在技术方法创新方面，研究团队开发了基于D?O标记与拉曼光谱联动的单细胞活性分选技术（RACS-Culture）。该技术通过检测细胞内新合成生物分子中C-D键的振动频率变化，实现了对活细胞代谢活性的精准量化。这种非侵入性检测手段有效克服了传统RNA测序或荧光标记技术中存在的样本降解、标记误差等问题，特别是在高温胁迫条件下仍能保持稳定的检测精度。通过单细胞拉曼分选技术，成功从低丰度菌群中分离出三个关键功能物种：毕赤酵母属（Pichia kudriavzevii）、异常毕赤酵母（Wickerhamomyces anomalus）和纤维毕赤酵母（Saccharomycopsis fibuligera），其中P. kudriavzevii展现出独特的热耐受特性。

研究揭示的时空分异机制具有典型工业发酵特征。在温度低于45℃的初、末期，纤维毕赤酵母主导糖类分解代谢，异常毕赤酵母则专司风味前体物质的合成。当温度突破45℃临界点时，这两个物种的活性显著下降，而原本占比仅5-8%的毕赤酵母属（P. kudriavzevii）通过以下机制实现功能跃升：首先，其基因组中wos2基因簇显著扩张，该基因簇编码的细胞壁修饰蛋白能有效增强细胞在高温下的机械稳定性；其次，FLO8基因家族的扩增使其表型调控网络具备更强的热适应性。具体表现为：当环境温度超过50℃时，P. kudriavzevii的细胞聚集效率提升3.2倍，其细胞膜热休克蛋白表达量达到其他物种的5-7倍，这种物理屏障与分子保护的双重机制使其成为唯一能稳定存活于60℃高温区的功能菌株。

在功能代谢层面，研究构建了动态代谢图谱。通过合成社区实验发现，不同酵母物种的代谢分工具有明确的时空特征：在42℃以下阶段，纤维毕赤酵母负责将淀粉分解为还原糖（葡萄糖/果糖转化率提升40%），异常毕赤酵母则完成氨基酸脱羧生成挥发性酯类（酯类产量增加2.8倍）；当温度超过48℃时，毕赤酵母属启动乙醇脱氢酶系统，其乙醇生成速率达到其他菌种的3倍以上，同时通过增强细胞间粘附（热休克蛋白介导的β-葡聚糖网络形成）维持菌群结构稳定性。

该研究首次在工业发酵体系中验证了"低温功能互补，高温优势物种"的动态分异规律。通过连续追踪发酵过程发现：在温度波动阶段（42-48℃），菌群呈现多态共存特征，不同物种通过代谢产物的互作形成协同效应；但当温度稳定超过50℃时，毕赤酵母属通过以下策略建立生态位优势：1）细胞壁多糖合成量增加2.1倍，形成耐高温的物理屏障；2）热休克蛋白Hsp70和Hsp90的表达量分别达到对照组的8.3倍和6.7倍；3）乙醇脱氢酶活性提升至常温的3.4倍，这种酶活性与热休克蛋白的表达呈现显著正相关。

基因功能分析显示，wos2基因簇的扩张使P. kudriavzevii获得独特的细胞壁重塑能力，其细胞壁多糖中的β-1,3-葡聚糖含量增加57%，这种结构变化不仅能抵抗高温导致的膜流动性异常，还能增强细胞在发酵体系中的粘附性，促进形成稳定的生物膜结构。同时，FLO8基因家族的扩增增强了表型可塑性调控能力，该基因簇包含超过200个调控元件，使菌株能够根据温度梯度动态调整能量分配策略——在42℃时优先激活糖酵解相关基因（如PFK1、ADH1），而在48℃以上则显著增强乙醇脱氢酶（ADH4）和细胞膜保护蛋白基因（如HSP20）的表达。

研究建立的"代谢活力-物种丰度"双维度评估体系具有重要方法论价值。通过将单细胞拉曼光谱检测的代谢活性指数（CAI）与宏基因组测序的物种丰度数据时空叠加，发现活性菌群存在显著的时间滞后现象。例如在S1（7天）阶段，检测到的活性菌群占比仅12%，但通过RACS-Culture技术分选出的P. kudriavzevii此时已占功能代谢群落的38%；至S3（40天）高温阶段，该比值进一步攀升至67%。这种滞后性揭示了微生物群落从"应激存活"到"功能主导"的转化过程，为工业发酵中功能菌的早期筛选提供了理论依据。

在工业应用层面，研究提出的"三阶段功能强化策略"已在中国茅台酒厂完成中试验证。通过定向接种P. kudriavzevii热耐受菌株，在50℃发酵阶段将乙醇产率提升19.6%，风味物质多样性指数增加42.3%。更值得关注的是，该技术使发酵过程的热稳定性窗口从原来的45-48℃扩展至50-55℃，成功将生产周期缩短3.2天。在安全评估方面，基因组测序显示目标菌株的接合转移相关基因（如traY、traT）表达量低于工业菌标准的0.7%，且通过宏基因组特征分析确认其未携带抗生素抗性基因簇。

该研究对传统发酵工艺的优化具有双重指导意义：一方面证实了"低温协同，高温主导"的群落动态规律，为多阶段工艺调控提供了理论支撑；另一方面揭示了单细胞水平的功能特性差异，为精准菌株选育开辟新路径。特别是在极端环境微生物功能解析领域，建立了"代谢活性动态监测-功能基因定向解析-合成社区验证"三位一体的研究范式，这对开发耐高温工业菌群、提升生物制造过程稳定性具有重要参考价值。