《Microchemical Journal》：Comprehensive characterization of chemical components in Wenjing decoction by offline two dimensional liquid chromatography-high resolution mass spectrometry and gas chromatography–mass spectrometry
编辑推荐：
稳贞汤质量控制研究采用LC-HRMS和GC-MS联用技术系统分析其非挥发性（401种）和挥发性（129种）成分，填补传统中药制剂挥发油综合研究的空白，为质量标准化提供科学依据。
孙燕|周静|胡玉欣|何晴晴|周洋|闵晓月|张子佳|侯金军|龙华莉|吴婉莹|郭迪
中国科学院上海药物研究所中医标准化技术国家工程研究中心，上海中医药现代化研究中心，上海201203，中国
摘要
温经汤是一种以调节血液功能著称的传统中药，主要用于治疗女性妇科疾病。尽管在临床应用中非常广泛，但其质量控制仍存在不足，尤其是在其挥发性成分的全面表征方面。这些挥发性成分对温经汤的治疗效果至关重要，但在传统分析方法中常常被忽视。为了解决这一问题并提供更全面的化学成分谱，我们采用了两种互补的分析方法：离线二维液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）和气相色谱-质谱（GC-MS）。通过LC-HRMS，我们成功鉴定了401种非挥发性化合物，这些化合物被分类为萜类、黄酮类、有机酸、苯丙素类和内酯类。GC-MS分析鉴定了129种挥发性成分，包括倍半萜类、单萜类、醇类和酯类。这些发现填补了温经汤挥发性成分系统表征的空白，并为复杂中药制剂的化学成分分析提供了全面的方法。这些结果不仅有助于确定潜在的质量控制指标，也有助于温经汤在临床实践中的标准化和质量保证。
引言
温经汤是一种在临床中广泛使用的传统中药方剂，主要用于治疗痛经和月经不调等妇科疾病[1,2]。该方剂由九种具有复杂药理特性的中药组成，包括肉桂皮（切片处理）（CC）、姜黄根（醋处理）（CR）、当归根（酒处理）（ASR）、川芎根（切片处理）（CXR）、白芍根（切片处理）（PRA）、牡丹皮（切片处理）（MC）、人参根及根茎（切片处理）（GRR）、甘草根及根茎（炙制）（GR-R）和牛膝根（醋处理）（ABR）。尽管温经汤在临床应用已有悠久历史，但对其质量控制的研究仍然有限。目前对温经汤的化学成分分析主要集中在非挥发性成分上，而忽略了可能具有显著药理作用的挥发性成分。为了阐明温经汤的治疗效果的物质基础并改进其质量评估体系，必须采用现代科学方法对其化学成分进行全面研究。
液相色谱-质谱（LC-MS）是表征化学成分的常用技术[3]。先进的技术如超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）已成功分离并鉴定了多种相关中药制剂中的化合物。然而，这些方法在色谱峰容量和大极性成分的保留方面可能存在局限性。为了解决这些问题，采用了包括在线和离线二维液相色谱-高分辨率质谱（离线2D LC-HRMS）在内的多维色谱技术。这些方法与四极杆轨道阱高分辨率质谱（Q-Orbitrap-HRMS）结合使用，显著提高了复杂中药化合物的表征效果[[4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]]。在离线三维色谱系统中使用离子交换色谱（IEC）、亲水相互作用色谱（HILIC）和反相色谱（RPC）也取得了良好效果[13]。此外，结合多种采集模式的综合数据收集策略对化学成分表征更为有效[[14], [15], [16]]。全扫描模式、数据依赖采集（DDA）和数据独立采集（DIA）等方法被用来最大化不同采集模式的优势[17,18]。通过应用不同的数据处理策略（如质量损失过滤和中性损失过滤），可以深入挖掘质谱信息，从而鉴定出更多的化学成分[16,[19], [20], [21]]。化学成分的表征使用了Progenesis QI、UNIFI、MS-DIAL、GNPS、MS-Finder等软件[19,[22], [23], [24], [25]]。
对于挥发性成分，通常使用气相色谱-质谱（GC–MS），并结合顶空固相微萃取（HS-SPME）来提高挥发性分析物的提取效率[[26], [27], [28], [29]]。诸如顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（HS-SPME-GC–MS）和顶空-气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）等技术已被成功应用于中药制剂的成分分析，包括非挥发性成分和挥发性成分[30]。
由于温经汤中含有挥发性和非挥发性生物活性成分，仅用一种检测方法来表征所有成分是不切实际的。本研究采用了离线2D LC-HRMS，通过集成不同分布特性的色谱柱来提高色谱峰容量和分离能力，有效地表征了温经汤中的非挥发性化学成分。同时，GC–MS用于表征挥发性成分。这种双重方法有助于全面了解温经汤的化学组成，从而推动基础研究并为该中药方剂的质量控制提供参考。
材料与试剂
共购买了21种参考标准品，来自中国食品药品检定研究院，包括尿苷、腺苷、鸟苷、芍药花素、β-ecdysterone、阿魏酸、甘草苷Rg1、甘草苷Re、甘草苷Rb1、甘草酸铵、莰烯、L-樟脑、Bornol、丁香酚、芍药醇、姜黄酚、姜黄酮和Gemarone。另外还从上海标准技术有限公司购买了10种参考标准品。
关键参数优化
首先对离线二维液相色谱（离线2D LC）系统进行了色谱柱筛选。C18反相色谱柱因其出色的分离能力和与质谱的兼容性而常用于第二维分离。因此，在本研究中使用了反相色谱柱进行第二维分离。
结论
本研究通过蒸汽蒸馏收集了挥发油，并对温经汤中的非挥发性及挥发性化学成分进行了表征。通过离线2D LC-HRMS和GC–MS结合使用，阐明了温经汤的全面化学组成。离线2D LC-HRMS共鉴定了401种非挥发性成分，其中218种在正离子模式下、183种在负离子模式下被鉴定。主要鉴定的化合物包括萜类、黄酮类和有机酸等。
CRediT作者贡献声明
孙燕：撰写初稿、数据整理。周静：验证、方法学设计、数据分析。胡玉欣：验证、实验设计、数据分析。何晴晴：资源获取、实验设计、数据整理。周洋：数据可视化、软件应用、资源协调。闵晓月：验证、数据整理。张子佳：撰写、审稿与编辑、数据可视化。侯金军：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金申请、概念构思。龙华莉：撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划[资助编号：2023YFC3504200和2022YFC3501700]以及深圳医学专项[资助编号：SZZYSM202106004]的财政支持。
