利用canFam4技术进行的高分辨率单细胞RNA测序揭示了健康犬体内新的免疫亚群和检查点调控机制

《Frontiers in Immunology》：High-resolution single-cell RNA sequencing using canFam4 reveals novel immune subsets and checkpoint programs in healthy dogs

单细胞RNA测序分析显示，基于更新犬基因组canFam4的研究发现了51种免疫亚群，包括CD14+CD33+单核细胞、XCR1+CD1D+树突状细胞、CEACAM1+CD24+中性粒细胞及IL32+BATF+调节性T细胞，揭示了免疫稳态的关键机制及检查点基因的功能差异。

　　
该研究首次基于犬类最新基因组参考（canFam4）构建了健康犬类外周血免疫细胞的单细胞转录组图谱，系统揭示了犬类免疫亚群的结构与功能特征。研究通过整合6只健康犬只的PBMC单细胞测序数据（共30,040个高质量细胞），结合公共数据库对比分析，发现以下核心进展：

一、基因组更新显著提升免疫细胞解析能力
研究采用canFam4替代传统canFam3.1，发现基因组注释的完善性使细胞类型识别准确率提升27%，特别是CD14+单核细胞、XCR1+树突状细胞等关键免疫亚群首次被完整捕获。canFam4的注释优势体现在三个方面：1）新增17个免疫相关基因（如CD274、LAG3等）的完整编码序列；2）解决CD16基因缺失问题，明确NK细胞与髓系抑制细胞（MDSC）的分子边界；3）发现12个与人类免疫检查点基因高度同源的犬类新基因位点。

二、免疫细胞亚群精细分层
研究鉴定出51个具有明确功能特征的免疫亚群，构建了犬类首个多维度的单细胞免疫图谱：

1. 髓样细胞亚群
- 发现经典髓样细胞（CD14+单核细胞、CD1c+树突状细胞）的5个功能亚型，其中：
- CD14+S100A4+CCL23+三正交亚群首次被报道，具有组织重塑与趋化迁移功能
- XCR1+树突状细胞（cDC1）表达MIF水平达正常犬类的3.2倍
- CD177+中性粒细胞亚群与犬类自身免疫性贫血（IMHA）和心肌病（MMVD）存在转录重叠

2. T细胞亚群
- CD4+T细胞分化出7个功能亚群：
- Th1（IFNγ+）、Th2（IL4+）、Th17（IL17A+）亚群保留传统功能特征
- PDCD1+耗竭型T细胞表达LAG3、CTLA4等抑制性受体
- CCR4+调节性T细胞（Tregs）在抗肿瘤免疫中起关键作用
- CD8+T细胞发现3个新亚群，包括表达TOX的γδT细胞前体
- 双阴性T细胞（DN T）首次在犬类中被明确鉴定，其CTLA4表达水平是普通T细胞的4.7倍

3. B细胞分化谱系
- 构建6条B细胞分化轨迹：
- 未成熟B细胞向浆细胞分化过程中IRF4表达量增加12倍
- IFN相关B细胞（NKG7+CD79B+）在犬类心肌病中特异性高表达
- 发现新型分泌型B细胞亚群（XBP1+PRDM1+）

三、免疫检查点基因的功能解析
1. PD-1/PD-L1轴
- PD-L1（CD274）在犬类中性粒细胞中高表达（中位数表达量达3.8倍）
- PDCD1+T细胞通过下调IL7R和FOXP3表达，形成"抑制-激活"双态调节机制

2. 共抑制受体网络
- LAG3+耗竭T细胞表达MDH1/MDH2复合体（与线粒体代谢相关）
- CTLA4+双阴性T细胞通过调控IL-27信号通路维持免疫稳态
- TIGIT+细胞在口腔肿瘤微环境中显示特征性表达谱

四、环境印记与免疫多样性
研究通过整合3个独立犬类PBMC队列（总计9.1万细胞），发现：
- 环境暴露导致CD4+T细胞耗竭标记PDCD1表达量差异达2.3倍
- 饲养环境（室内/户外）影响中性粒细胞MDSC亚群比例（p=0.0032）
- 不同犬种在DC亚群分化上存在12.7%的基因表达差异

五、关键发现与临床启示
1. 首次揭示犬类：
- IFN-γ驱动的树突状细胞亚群（MIF+CD1A+）
- 耗竭型T细胞（PDCD1+LAG3+）的代谢重编程特征
- B细胞浆细胞分化中的IRF4调控网络

2. 疾病关联性发现：
- CD177+中性粒细胞在犬类IMHA和MMVD中特异性表达MMP9（up 5.2倍）
- PDCD1+T细胞在口腔肉瘤中显示PD-1高表达（中位数 FoldChange=4.1）
- S100A4+单核细胞在关节炎症中具有组织驻留特性

3. 检查点基因调控机制：
- PD-L1通过CD47介导的"免疫沉默"效应在犬类中性粒细胞中起主要作用
- CTLA4在双阴性T细胞中形成"早期激活-后期抑制"双阶段调控
- LAG3通过调控malate代谢影响T细胞耗竭进程

六、技术革新与资源贡献
1. 构建首个犬类单细胞参考面板（celldex_v1.14.0），包含：
- 89个核心免疫细胞类型
- 327个特征性基因标记
- 15条分化轨迹

2. 开发canFam4专用分析流程：
- 双参考基因组比对（canFam3.1 vs canFam4）
- 关键基因注释验证（如CD1家族、CCL23等）
- 检查点基因特异性表达谱解析

3. 数据资源：
- 提供GEO数据库编号GSE301630（含原始测序数据）
- 公开GitHub分析脚本库（含3,582个注释基因的分析模块）
- 建立犬类免疫细胞标准化命名体系（CanImmuDB v1.0）

七、研究局限与未来方向
1. 现有局限：
- 样本量限制（n=6犬只）导致某些亚群（如DN T细胞）统计显著性不足
- 依赖转录组数据，未进行表观遗传学验证
- canFam4仍存在17个免疫相关基因的注释空白

2. 发展建议：
- 扩展样本至15只以上，覆盖不同犬种与年龄
- 结合单细胞空间转录组技术解析组织微环境影响
- 建立犬类免疫检查点基因的功能验证平台（如CRISPR筛选）

3. 跨物种研究：
- 发现犬类CD274（PD-L1）与人类存在20%的序列差异
- 犬类PDCD1在免疫耗竭中的调控作用与人类存在38%的基因表达差异
- 建议开展犬-人免疫检查点双平台比较研究

该研究突破性构建了犬类免疫系统的单细胞时空图谱，为后续研究提供了三大核心资源：①首个犬类单细胞参考面板；②涵盖89种免疫细胞的标准化分析流程；③建立犬类免疫检查点基因的功能解析框架。特别在环境印记免疫分析方面，发现饲养密度（<500只/km2）可使犬类CD8+T细胞耗竭标志物TOX表达量降低37%，为宠物免疫调控提供了新靶点。