《Analytica Chimica Acta》：Novel and practical spectrophotometric method for urea determination using p-dimethylaminobenzaldehyde reagent system augmented with chromotropic acid
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尿素测定新方法采用PDAB与铬酸二钠双试剂系统，通过硫酸调节制备稳定显色液，运用响应面法优化配比，实现0.83-33.30 mM宽范围检测（R2>0.99），检测限0.34 mM，回收率90-110%，抗氨、硝酸盐等干扰，适用于化肥工业质量控制。
Hany Hassan El-Feky
阿布基尔化肥和化工公司实验室部门，埃及亚历山大，邮政信箱21911
摘要
在临床、工业和环境应用中，可靠地测定尿素对于质量控制、诊断和过程监控至关重要。基于对二甲氨基苯甲醛（PDAB）的传统分光光度法通常存在试剂稳定性差和重现性有限的问题，这影响了分析的可靠性。本研究描述了一种实用的分光光度程序，该程序采用了一种新型的双试剂系统，该系统由PDAB和变色酸的二钠盐组成，这两种试剂均使用规定体积的浓硫酸制备，并以等体积混合以生成稳定的显色溶液。通过响应面方法学框架下的中心组合设计优化了试剂组成，以确保最大的吸光度和显色剂的稳定性。方法验证遵循了《水和废水检测标准方法》第1040部分的要求，确认了在33.30 mM范围内的强线性（R2 > 0.99），检测限和定量限分别为0.34 mM和0.83 mM。在0.83、16.65和33.30 mM浓度下的回收率在90%到110%之间，实验室间的相对标准偏差不超过6%。所形成的显色剂反应迅速且稳定。研究了氨、铵盐、胺类、硝酸盐、甲醛、硫代半卡巴肼和肼的干扰，并对肼应用了标准去除程序。该方法克服了传统PDAB测定的长期局限性，简化了试剂制备过程，缩短了分析时间，并确保了在不同基质中尿素的分光光度定量。
引言
尿素是全球农业的重要组成部分，占全球使用氮肥的一半以上。由于其46%的氮含量、相对化学稳定性和低生产成本，尿素仍然是大规模农业和工业应用的首选氮源[1]。同样，尿素分析在多个领域变得越来越重要，包括临床诊断、工业环境、环境监测和食品安全[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。根据样品基质和所需灵敏度的不同，测定尿素的分析方法也有很大差异。化学衍生化结合分光光度检测已成为许多常规实验室的首选方法，因为这种方法使用方便、成本低且仪器要求简单[4]、[9]。该方法涉及在酸性条件下使尿素与醛类或酮类反应生成有色显色剂，然后通过比色法进行定量[10]。在已建立的衍生化试剂中，二乙酰单肟（DAM）和邻苯二甲醛（OPA）显示出满意的结果，但每种方法都有其局限性。DAM方法通常需要加热和较长的反应时间，而OPA使用潜在的致癌试剂。尽管使用了变色酸进行改良，但反应仍需加热和额外时间（例如37°C下20分钟），使其不适合快速或现场分析[11]、[12]。相比之下，对二甲氨基苯甲醛（PDAB）具有明显优势：它可以在室温下与尿素反应，无需苛刻条件或复杂设备。然而，基于PDAB的方法仍存在一些缺点，如在水介质中的溶解度低和显色剂稳定性有限。在酸性条件下试剂降解会增加变异性并降低重现性[4]、[13]、[14]、[15]、[16]。
El-Feky之前开发并验证了一种使用溶于水和冰醋酸中的PDAB进行尿素测定的分光光度法，证明了基于PDAB的比色法在实际基质中的适用性。采用实验设计（DOE）策略优化了试剂组成，从而提高了肥料基质中的显色剂形成、稳定性和重现性。该方法有助于检测工业样品中的低浓度尿素[4]。相比之下，本研究提出了一种根本不同的配方，即将PDAB与变色酸的二钠盐（C.A.）结合使用，两种组分以规定体积的浓硫酸（S.A.）混合。据我们所知，这是第一项描述在分光光度尿素测定中使用C.A.作为共试剂的研究。这种新型双试剂系统（PDAB/C.A.）旨在提高显色剂的稳定性，并将分析范围扩展到适合常规工业分析的水平。虽然之前的方法针对低浓度测定进行了优化，但当前配方实现了更好的稳定性和更宽的工作范围。使用基于DOE的优化方法确定了最佳变量组合，旨在增强颜色强度、提高鲁棒性和增加对样品变异性的耐受性。采用响应面方法学（RSM）下的中心组合设计（CCD）对新型双试剂系统进行了优化，从而高效地探索实验变量，同时减少了所需的测试次数[4]。方法验证遵循了APHA指南（方法1040），包括线性、选择性、精确度以及来自氨、铵盐、肼、羟胺化合物、甲醛、硝酸盐和硫代半卡巴肼等化合物的干扰评估[17]。研究表明，这种新提出的双试剂系统可以使用容易获得的试剂和标准实验室设备轻松实施，为常规尿素测定提供了一种稳定、灵敏且可重复的替代方法——特别是在化肥实验室和工业质量控制环境中。
化学品和仪器
补充信息提供了本研究中使用的化学品和仪器的相关信息。
标准尿素溶液的制备
通过将2.0克预热后的尿素（70°C，2小时）溶解在去离子水中并稀释至1升来制备储备溶液。工作溶液在0.83至33.30 mM的不同浓度下新鲜制备，具体为0.83、1.67、3.33、11.66、16.65、24.75和33.30 mM。
新型双试剂系统的制备
双试剂是通过将分别制备的PDAB和C.A.溶液以等体积混合而成。
初步筛选研究
研究首先确定了尿素与新型双试剂反应生成的黄绿色显色剂的λmax值。还探讨了将C.A.加入试剂混合物中的效果。PDAB在水中的溶解度较低，但在强酸（如硫酸或盐酸）中溶解得更好。然而，在高酸性环境中，与尿素的显色反应会受到阻碍，从而影响生成显色剂的稳定性[4]。
结论
成功开发了一种稳健且可重复的分光光度方法，用于测定广泛的尿素浓度范围（0.83–33.30 mM）。该方法采用了一种新型双试剂系统，由PDAB和变色酸的二钠盐组成，这两种试剂均使用规定体积的浓硫酸制备，并以等体积混合以生成稳定且有效的显色溶液。新型双PDAB/C.A.试剂的摩尔比在混合前通过CCD进行了优化。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
资助
本工作得到了阿布基尔化肥和化工公司实验室部门的财务支持。
致谢
El-Feky博士衷心感谢阿布基尔化肥和化工公司实验室部门在整个研究过程中的持续支持和帮助。
