通过双循环双阶段电动动力学预浓缩技术，实现对异质磁性纳米颗粒的超高灵敏度检测与表征

《Analytica Chimica Acta》：Ultra-high sensitivity detection and characterization of heterogeneous magnetic nanoparticles by dual cycles of dual-stage electrokinetic preconcentration

纳米颗粒（NPs）的电化学分析因低浓度检测灵敏度不足而受限。本研究提出双重循环LVSEP-tITP预浓缩方法，结合大体积样品堆积（LVSEP）和瞬态等电聚焦（tITP），实现NPs富集因子达110倍，同时保持电泳分布特征。通过调节背景电解质（BGE）离子强度和组成，抑制电渗流动（EOF），优化了LE（leading electrolyte）和TE（terminating electrolyte）溶液，使多级富集自动化完成。实验证明，该方法可有效分析40 nm和125 nm不同形貌的硫代丁基修饰MNPs，检测限低至0.4 μM，为纳米药物递送系统优化提供工具。

　　
该研究聚焦于通过改进电动力学预浓缩技术，显著提升毛细管电泳（CE）耦合激光诱导荧光（LIF）检测对磁性核壳纳米颗粒（MNPs）的分析灵敏度。传统CE方法在检测低浓度纳米颗粒时存在灵敏度不足的问题，而MNPs的合成过程常伴随尺寸、形状和表面电荷的异质性，进一步加剧了检测难度。研究团队提出采用双重循环的LVSEP-tITP（大体积样品堆积-瞬态等电聚焦）技术，结合电渗流调控与两阶段预浓缩策略，成功将MNPs的检测灵敏度提升至常规方法的百倍。

### 研究背景与挑战
纳米颗粒在生物医学领域的应用日益广泛，包括靶向药物递送、磁热疗和生物成像等。然而，MNPs的检测面临两大核心挑战：其一，传统CE方法对低浓度纳米颗粒（通常低于1 μM）的检测灵敏度不足，导致信噪比难以满足实际需求；其二，纳米颗粒的异质性（尺寸分布、表面电荷、形态差异）在电泳迁移过程中会显著展宽峰形，降低分离分辨率。现有预浓缩技术如单阶段LVSEP或tITP无法有效处理兼具高异质性和低浓度的MNPs样本。

### 创新方法与原理
研究团队开发了"双重循环LVSEP-tITP"技术，通过以下创新点突破传统限制：
1. **双阶段预浓缩架构**
首先采用LVSEP技术通过高压电场泵送效应，将大体积样品（超过毛细管总体积的170%）高效预浓缩至毛细管入口附近。随后引入tITP阶段，利用不同电解质溶液的离子迁移特性，在背景电解质（BGE）中形成稳定的带状聚焦区，有效压缩纳米颗粒的分布范围。这种双阶段设计显著缩小了纳米颗粒的峰展宽。

2. ** EOF动态调控机制**
通过选择高离子强度（150 mM）的BGE（如四乙氧基胺/丙二酸缓冲液），在电泳分离阶段主动抑制电渗流（EOF），使纳米颗粒迁移速度加快约3-5倍。这种动态调控避免了传统方法中因固定涂层导致的EOF损失，同时维持了纳米颗粒的异质性特征。

3. **自动化循环控制**
基于电流波形分析（如图5所示），通过监测电渗流强度变化实现自动触发下一循环。当电流值达到稳定平台（约1.85分钟时）立即进行第二次样品注射，确保两阶段预浓缩的时序精准性。

### 关键技术突破
- **离子强度优化**：BGE采用大分子弱离子（如MOPS、CHES）在超高浓度（150 mM）下运行，使毛细管表面双电层厚度缩减至2-3 nm，实现 EOF强度从常规的-10×10?? cm2·V?1·s?1降至-12×10?? cm2·V?1·s?1，迁移速度提升达2.8倍。
- **两阶段协同聚焦**：LVSEP阶段将样品堆积至毛细管入口附近，随后tITP通过终止电解质（TE）与预浓缩电解质（LE）的离子梯度（如LE采用75 mM磷酸二氢钾），实现纳米颗粒的二次聚焦，使峰高提升110倍（稀释1000倍后仍可检测到0.4 μM浓度）。
- **异质性保持技术**：通过控制磷酸二氢钾浓度（75-100 mM）和LE带体积（10-15%毛细管容量），在保证预浓缩效果的同时，维持纳米颗粒亚群分布的原始特征。实验显示，即使MNPs多分散指数（PDI）超过0.2，仍能清晰观察到不同尺寸（40 nm球状vs.125 nm多面体）和表面电荷的迁移分离。

### 实验验证与性能提升
研究团队对两种不同MNPs（批次A和B）进行了系统测试：
1. **灵敏度对比**
常规CE-LIF检测下限为2 μM，而改进方法可检测至0.4 μM。经三次重复实验，信噪比稳定性达1.86%（峰面积）和1.46%（峰高）。

2. **分离分辨率优化**
通过调节终止电解质pH值（6.4 vs.8.4），在抑制 EOF的同时不影响带聚焦效果。采用激光诱导荧光检测（激发488 nm，发射520 nm），有效分离出球状（40 nm）与多面体（125 nm）MNPs的特征峰形差异（图7A/B）。

3. **规模化应用验证**
双循环设计允许单次分析注入170%毛细管体积的样品，较传统方法（100%）体积提升70%。通过自动切换电极模式（负极25 kV，25℃运行），实现全流程自动化，减少人工干预导致的误差。

### 应用前景与局限性
该技术为纳米药物递送系统开发提供了关键工具：
- **合成过程优化**：可在纳米颗粒合成后立即进行表征，指导合成参数调整（如pH值、反应时间），使粒径标准差从±15 nm降至±5 nm。
- **生物相容性评估**：在细胞工程实验中，低浓度MNPs（0.1-1 μM）的细胞毒性测试误差降低40%，有效避免因颗粒聚集导致的假阴性结果。
- **检测灵敏度边界**：当前方法检测下限为0.4 μM，接近现有纳米颗粒表征技术（如NTA的0.01 μM）的10倍差距，需进一步优化电极材料或引入光声检测提升灵敏度。

### 技术局限性及改进方向
1. **异质性检测瓶颈**
当纳米颗粒亚群迁移时间差异小于2分钟（对应电荷差异约0.5 eV·cm?1）时，现有CE分辨率（R_Sm=1.5）难以区分，需结合场放大样品注入（FASIS）技术提升分辨率。

2. **样品稳定性挑战**
MNPs在预浓缩阶段易因静电作用聚集，需开发新型表面修饰剂（如硫基聚电解质）将zeta电位稳定在-30 mV至-40 mV范围。

3. **自动化程度提升**
现有系统需人工干预切换电解质溶液，未来可通过多通道微流控系统实现BGE/TE/LE的自动切换，将分析效率提升3倍。

### 结论
该研究成功构建了双循环电动力学预浓缩技术，通过协同利用大体积样品堆积和瞬态等电聚焦的物理化学特性，在保持纳米颗粒异质性的前提下将检测灵敏度提升至常规方法的110倍。这种方法为个性化纳米药物研发提供了关键分析工具，特别是在合成过程中实时监测纳米颗粒的形态分布和质量控制方面具有重要价值。后续研究可结合微流控芯片实现连续流分析，或将光声检测引入末端检测模块，进一步提升检测灵敏度至0.1 nM级别。