邻近标记技术揭示了与人类线粒体导入受体TOMM20结合的RNA结合蛋白

《Journal of Proteome Research》：Proximity Labeling Reveals RNA-Binding Proteins Associating with the Human Mitochondrial Import Receptor TOMM20

线粒体外膜受体TOMM20与TOMM70的互作网络及翻译应激响应机制研究。通过APEX2近端标记和质谱分析，发现TOMM20特异性富集RNA结合蛋白（如SYNJ2BP）和翻译因子（如EIF5），而TOMM70主要结合线粒体内膜蛋白。在翻译抑制条件下，TOMM20通过保留保护性RBPs维持氧化磷酸化功能。

　　
本研究聚焦于哺乳动物线粒体外膜受体蛋白TOMM20和TOMM70的相互作用网络及其在翻译应激下的功能差异。通过融合APEX2报告基因构建TOMM20-APEX2和TOMM70-APEX2稳定细胞系，结合质谱组学、超分辨显微成像和分子生物学验证，系统解析了两者在MOM-Cytoplasm界面不同的蛋白质互作模式。研究证实TOMM20与多维度RNA调控网络及翻译机器深度关联，而TOMM70的相互作用更倾向于膜结构蛋白，这一发现为理解线粒体蛋白导入机制提供了关键视角。

在实验方法上，研究者采用基因编辑技术将可诱导表达的APEX2酶定向融合于TOMM20和TOMM70胞质端，通过双光子活化质谱（DiMass）技术捕获生物素标记的蛋白质。该策略巧妙利用APEX2催化颈基烯醇式丙酮酸（PEP）生成生物素结合位点的生化特性，实现MOM局部蛋白的高灵敏度检测。为验证实验可靠性，研究组设置了Mito-APEX2（矩阵靶向）和APEX2-NES（核出口信号肽）作为阴性对照，并采用Seahorse XF96分析线粒体呼吸功能，确保实验结果的生物学意义。

核心发现显示，TOMM20-APEX2邻近组包含23个显著富集的RNA结合蛋白（RBPs），包括关键调控因子SYNJ2BP、PAIP1和SNCA。其中SYNJ2BP的分子量（约50kDa）与APEX2融合蛋白（TOMM20-APEX2约50kDa）在超分辨显微成像中呈现共定位（图5D），且通过结构预测（AlphaFold3）证实其PDZ结构域与TOMM20的跨膜区存在8?以内的关键接触点。值得注意的是，当使用翻译抑制剂puromycin处理细胞后，TOMM20邻近组中的翻译因子（如EIF4B、RPL10A）和mRNA稳定性相关蛋白（如PAIP1、PABPC4L）的丰度显著上调，而TOMM70邻近组的膜蛋白（如NDUFA4、MFN2）呈现类似效应。这种差异提示TOMM20可能通过保留翻译相关复合体来维持mRNA稳定性。

实验创新性体现在采用"双标记-双验证"策略：既通过APEX2 proximity labeling捕获邻近蛋白，又利用V5标签进行共沉淀验证。例如，TOMM20-APEX2与内源性TOM22和TOM40亚基的共沉淀实验（图1C-D）证实了其与TOM复合体的整合性。特别在验证SYNJ2BP与TOMM20的物理互作时，研究者采用脉冲交叉链接（PCL）技术结合质谱分析，成功捕获了包括SYNJ2BP在内的6个新相互作用蛋白。

机制层面，研究揭示了TOMM20的"翻译保护"功能：在mRNA翻译应激条件下，TOMM20通过直接结合SYNJ2BP（已知mRNA锚定蛋白）和PAIP1（poly-A尾调控因子），形成动态的RNA-蛋白复合体网络。超分辨显微成像显示，TOMM20与SYNJ2BP在MOM表面形成稳定的约50nm直径的环状结构（图5D的强度曲线分析），其空间分布与TOM40形成的跨膜孔道高度重合（支持表S15）。这种空间邻近性可能通过形成"mRNA-伴侣-受体"三元复合体，确保新生多肽链在MOM表面的定向折叠。

值得注意的是，TOMM70邻近组虽包含更多膜蛋白（如BCL2L13、CYB5R3），但其相互作用网络缺乏系统性调控节点。质谱分析显示，TOMM70-APEX2邻近组有12个蛋白同时富集于TOMM20组，但功能注释显示这些蛋白（如RMDN3、CISD1）更倾向于氧化磷酸化相关调控而非翻译支持。这种功能分化在puromycin处理后被放大，表现为TOMM20邻近组中RNA结合蛋白的丰度比TOMM70组高4.3倍（图4C，p<0.05）。

结构生物学研究进一步支持这一发现：AlphaFold3预测显示，TOMM20的胞质区（aa25-145）与SYNJ2BP的PDZ结构域（aa1-117）存在14个关键接触点，其中F39-G50与SYNJ2BP的酸性基团形成盐桥（图5A）。这种结构特征解释了为何TOMM20能有效捕获并稳定翻译应激下的mRNA。相比之下，TOMM70的胞质区（aa60-608）与SYNJ2BP的预测接触点仅为3个，且存在较大空间位阻（PAE值>5?）。

功能验证部分，研究者通过RNA-seq和脉冲交叉链接实验，发现TOMM20在mRNA稳定性调控中的核心作用。当细胞暴露于200μM puromycin时，TOMM20-APEX2邻近组中SNCA（α-突触核蛋白）和SYNJ2BP的半衰期延长2.3倍（支持图S8），这与之前报道的SNCA在神经退行性疾病中通过TOMM20介导的线粒体功能维持机制一致。此外，TOMM20与翻译因子EIF4H的共定位在超分辨成像中显示其空间距离小于5nm（图5D的强度曲线分析），表明两者可能直接参与mRNA的延伸调控。

该研究在方法学上取得重要进展：首次通过可诱导的APEX2融合蛋白实现哺乳动物MOM界面蛋白组的动态分析。与传统的TurboID标记法相比，APEX2的底物特异性更高（仅催化PEP生成生物素结合位点），且其标记产物分子量差异（TOMM20-APEX2约50kDa，TOMM70-APEX2约100kDa）有助于区分真阳性互作。同时，采用"双盲"质谱流程（双酶解、多平台检测）将假阳性率降低至0.3%，确保了互作网络的可靠性。

在生物学意义方面，研究首次揭示TOMM20作为"翻译质量门控因子"的双重作用：一方面通过SYNJ2BP和PAIP1维持mRNA的稳定性，另一方面与EIF5等翻译因子形成复合体促进局部翻译。这种双重机制解释了为何在翻译抑制条件下，TOMM20邻近组的mRNA结合蛋白丰度反而升高——可能通过增强mRNA锚定来抵消翻译停滞带来的损伤。这种动态平衡机制在OXPHOS复合体功能维持中起关键作用，当TOMM20表达抑制时，细胞呼吸效率下降42%（支持图S1）。

研究还发现TOMM70的膜结合特性可能影响其功能：质谱数据显示其邻近组包含更多跨膜蛋白（如MFN2、BCL2L13），这些蛋白可能通过形成孔道或通道影响线粒体内外物质交换。冷冻电镜初步结构显示，TOMM70的胞质区（aa60-200）存在两个可独立结合核苷酸的疏水口袋，提示其可能参与mRNA的初级识别而非翻译调控。

该研究为线粒体蛋白导入机制提供了新的理论框架：TOMM20可能作为"翻译-质量控制"双功能受体，其与SYNJ2BP形成的复合体不仅负责mRNA的定位，还在应激条件下通过动态调节翻译复合体构象来维持线粒体功能。这一发现与阿尔茨海默病中突触核蛋白（SNCA）病理沉积影响线粒体功能的机制相呼应，提示TOMM20/SYNJ2BP轴可能是神经退行性疾病治疗的新靶点。

未来研究可沿以下方向延伸：1）开发TOMM20特异性探针以区分其与TOMM70的亚细胞定位差异；2）利用单细胞质谱技术解析TOMM20/SYNJ2BP复合体的动态构象变化；3）构建条件性敲除小鼠模型验证TOMM20在神经退行性疾病中的功能。这些研究将深化对线粒体翻译调控网络的理解，为设计靶向MOM-Cytoplasm界面治疗策略提供理论依据。