《Journal of Hydrology X》：Application of a novel branched-DNA assay to quantify killer immunoglobulin-like receptor (KIR) mRNA expression identifies tissue compartmentalization in na?ve and SIV-infected rhesus macaques
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KIR基因家族在恒河猴免疫反应调控中的作用及bDNA技术验证（
Karen Terry|Kyle W. Kroll|Rhianna A. Jones|R. Keith Reeves
美国北卡罗来纳州达勒姆市杜克大学医学院人类系统免疫学中心，先天与比较免疫学系
引言
< />+ T淋巴细胞分别是先天免疫和适应性免疫反应中的关键效应细胞，在抗病毒和抗肿瘤防御中发挥着重要作用。NK细胞通过多种先天受体家族提供快速、通常不依赖于抗原的细胞毒性反应，同时作为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的效应细胞，并能产生如干扰素（IFN）-γ等免疫调节因子，这些因子有助于塑造适应性免疫。相比之下，CD8+ T细胞能够识别由主要组织相容性复合体I类（MHC-I）分子呈递的特异性病毒肽，在抗原致敏和克隆扩增后靶向破坏受感染细胞。KIR主要表达在NK细胞上，但也存在于部分CD8+ T细胞中，通过与MHC-I分子的相互作用来调节其活化。这种调节机制使KIR在平衡控制NK细胞和T细胞效应功能的活化与抑制信号中起到关键作用（Smyth等人，2005；Sun和Lanier，2011）。这些细胞杀伤性细胞共同作用以限制病毒复制并维持免疫监视。KIR基因位于19号染色体19q13.4位置的白血细胞受体复合体（LRC）内，在基因内容和等位基因变异方面表现出广泛的多态性（Campbell和Purdy，2011）。这种遗传多样性导致个体间免疫反应存在显著差异。每种KIR蛋白具有两个（2D）或三个（3D）免疫球蛋白样胞外结构域，其胞质尾部的长度决定了其信号传导功能。长尾KIR（KIRxDL）通常通过免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIMs）传递抑制信号，而短尾KIR（KIRxDS）则通过与适配蛋白DAP12相互作用，通过免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAMs）来激活信号（Kruse等人，2010）。
恒河猴（RM）是研究多种免疫学和传染病的重要模型物种，包括疫苗测试、移植免疫学和慢性病毒感染。它们与人类的进化关系密切且免疫系统结构相似，有助于弥合啮齿动物模型与人类临床研究之间的差距（Gibbs等人，2007）。此外，恒河猴作为非人类灵长类动物模型，其KIR基因家族展现出的遗传多样性和多态性与人类非常相似，适用于探索KIR生物学和宿主-病原体相互作用。恒河猴感染猴免疫缺陷病毒（SIV）后可模拟人类免疫缺陷病毒（HIV）的免疫病理过程，如CD4+ T细胞的逐渐丧失、全身性免疫激活以及组织内病毒库的形成（Bostik等人，2010；Ling等人，2002）。该模型支持可控的、纵向的、组织特异性的采样，有助于深入研究黏膜免疫、病毒持续存在及神经侵袭等在人类中难以进行的研究。这些特性使得恒河猴特别适合研究慢性病毒感染引起的免疫变化。实际上，慢性SIV感染会导致NK细胞表型和KIR表达的动态变化，尤其是在次级淋巴器官中。在淋巴结中观察到表达KIR3DL的NK细胞亚群扩张，这可能是由于持续的抗原刺激和异常的MHC-I表达所致。此外，MHC-I分子呈递的病毒肽会影响KIR的结合，从而影响NK细胞的活化及病毒控制的效率（Kesmir等人，2015；Albrecht等人，2014）。
然而，由于KIR基因家族序列高度相似、存在多态性且转录水平通常较低，量化恒河猴中的KIR基因表达仍然具有挑战性（Albrecht等人，2014）。传统的基于PCR或RNA-Seq的方法常出现扩增偏差和交叉反应，限制了它们准确测量单个转录本的能力。为了解决这些问题，分支DNA（bDNA）检测方法具有高特异性和敏感性，已被证明能有效测量包括KIR在内的多态性免疫受体基因。在本研究中，我们使用bDNA检测方法（QuantiGene Plex Assay，Thermo Fisher Scientific, Inc.）测量了来自未感染和慢性SIV/SHIV感染的恒河猴外周血、脾脏和淋巴结单核细胞中的六个结构与功能各异的KIR基因——Mamu-KIR1D、KIR2DL04、KIR3DH、KIR3DH5、KIR3DL02和KIR3DL05的表达。选择这些基因是因为它们在谱系上的多样性、进化意义以及与SIV免疫反应的先前关联（Rizzo等人，2021）。通过使用bDNA检测方法，我们旨在证明其作为检测不同免疫组织和感染阶段KIR基因表达细微差异的敏感且特异的方法的有效性，从而为未来在非人类灵长类动物模型中进行KIR生物学研究建立可靠的方法。
实验片段
实验样本
本研究共使用了16只年龄在3至7岁之间的印度来源的成年恒河猴。这些动物来自Biomere Inc.（马萨诸塞州伍斯特）、Bioqual Inc.（马里兰州罗克维尔）、华盛顿国家灵长类动物研究中心（马萨诸塞州西雅图）和新英格兰灵长类动物研究中心（NEPRC；马萨诸塞州索斯伯勒）。它们的饲养遵循美国国立卫生研究院的《实验室动物护理和使用指南》及相关建议。
检测性能和板间重复性
QuantiGene Plex分析软件执行多种质量控制（QC）检查，如珠子计数、变异系数和线性评估，能够标记异常实验结果以供审查。我们在研究过程中分批处理了样本，完整数据集之间的比较未发现显著差异，质量控制指标也未标记任何问题板。讨论
本研究分析了SIV/SHIV阴性和SIV/SHIV阳性恒河猴的外周血单核细胞（PBMCs）、脾脏和淋巴结单核细胞中六个杀伤性免疫球蛋白样受体（KIR）基因——KIR1D、KIR3DH5、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR3DH和KIR3DL0的表达。我们采用了多重分支DNA（bDNA）技术进行这些分析，这是一种非酶促杂交方法，可避免扩增偏差并直接从组织裂解物中定量RNA。
结论
本研究展示了bDNA技术在分析非人类灵长类动物复杂免疫遗传模式方面的有效性。该方法无需酶促扩增即可实现多个KIR转录本的敏感、特异性和可重复测量，克服了高度序列相似基因家族带来的挑战。其高通量能力使得即使从有限的组织样本中也能分析基因表达，从而能够检测到细微的变化。
CRediT作者贡献声明
Karen Terry：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、数据分析。Kyle W. Kroll：数据可视化、验证、正式分析、数据管理。Rhianna A. Jones：撰写——审稿与编辑、资源获取、数据分析。R. Keith Reeves：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、资金筹集、概念构思。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院的研究资助项目P01AI162242和R01AI161010（资助给RKR）提供支持。资助方未参与本研究的设计、数据收集、解释或发表决定。
