《Journal of Microbiological Methods》：Experimental and computational approaches to adaptive viral evolution: Linking molecular variation to phenotypic outcomes
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病毒的高突变率与进化能力驱动动物宿主传播、疫苗逃逸和耐药性，需结合分子变异与表型关联研究。本文系统评估了假病毒系统、最小基因组、表面展示技术、深度突变扫描（DMS）和计算建模五大技术，构建了迭代研究框架。DMS与反向遗传学结合成功预测并验证了逃逸突变，揭示了复制与结合能力的权衡。各技术互补性显著：假病毒支持完整病毒功能分析，最小基因组规避生物安全风险，DMS量化突变效应，AI加速进化预测。这些技术协同为疫苗设计提供新策略，推动从被动应对到主动防控的转变。
黄彦峰|欧志英|薛曦|周慧玲|肖康鹏
中国南方医科大学衡阳医学院基础医学科学学院病原生物学研究所，中国衡阳421001
摘要
由于病毒具有高突变率和快速进化能力，它们对全球健康构成了持续的威胁，这导致了人畜共患病的传播、疫苗逃逸和药物抗性的产生。即使是单个氨基酸的替换也可能影响病毒的侵入性、受体结合能力、免疫逃逸或传播性，正如最近的流感、SARS-CoV-2和其他新兴病毒的爆发所显示的那样。要理解这些过程，需要将分子变异与表型后果联系起来。本综述总结了五种实验和计算技术——假病毒系统、迷你基因组检测、表面展示系统、深度突变扫描（DMS）和计算机模拟——这些技术共同构成了研究病毒适应性的迭代框架。DMS与反向遗传学的结合验证了计算机预测的逃逸突变，并揭示了传统检测方法无法捕捉到的结合能力和复制能力之间的权衡。我们讨论了每种方法的优点和局限性，强调了它们的协调使用如何支持基于机制的疫苗和抗病毒策略的评估和数据驱动的设计。
引言
病毒，特别是RNA病毒，本质上容易发生突变，从而推动持续的遗传多样化（Fitzsimmons等人，2018年）。这种变异通过多种机制产生，包括点突变、插入和删除、重组以及分段病毒中的基因组重排。越来越多的证据表明，即使是微小的氨基酸变化也会影响病毒的传播性、毒力或免疫逃逸，偶尔还会引发大规模的疫情（Oraby等人，2025年；Lin等人，2024年）。1918年的“西班牙流感”大流行就体现了基因组重排的潜在危害（Tumpey等人，2005年）。在21世纪，类似的遗传机制继续产生高风险病原体（Burrough等人，2024年；Gao等人，2013年；Uyeki等人，2024年）。在SARS-CoV-2的进化早期，D614G突变通过增加ACE2亲和力增强了病毒的感染性（Korber等人，2020年）。随后，如Omicron变体中的L452Q/R等受体结合域突变进一步改变了抗原性并促进了免疫逃逸（Cao等人，2022年）。
历史上，病毒进化研究主要依赖于操作活病毒。然而，这种策略受到重大生物安全风险和实验可控性限制的阻碍。活病毒往往难以获得，通常仅适用于低通量筛选或针对特定机制的研究。此外，全面探究病毒进化通常需要额外的互补技术，进一步增加了实验的复杂性。报告的实验室安全事件突显了这些风险，并强调了需要更安全和实验更精确的方法。
为了克服这些挑战，开发了假病毒、复制子和迷你基因组平台等替代系统。这些系统提高了实验安全性，同时允许对病毒感染的特定阶段进行可控且可重复的分析。从病毒学研究的角度来看，我们关注病毒突变、表型变化及其由潜在因素驱动的结果。值得注意的是，COVID-19的出现加速并扩展了多种实验和计算技术在病毒进化研究中的应用。据我们所知，现有综述文献中缺乏全面的跨平台综合分析。因此，通过实际应用，本综述介绍了在受控实验室环境中研究病毒进化的实验策略，并对其应用范围和方法特征进行了评估。
在实践中，单一实验方法无法充分应对病毒突变景观的复杂性。高通量突变和基于人工智能的分析等互补方法进一步扩展了系统探索病毒突变功能后果的能力（Choi等人，2024年）。阐明这些过程为研究人员提供了基础病毒学的方法工具。这些工具反过来可以支持对新出现的病毒趋势的预测、广谱疫苗的合理设计以及抗病毒药物靶点的优化。总体而言，这些发展为研究病毒进化动态提供了更安全、更灵活的基础，加快了进化轨迹的阐明，并促进了从被动应对向主动预测和预防的转变。
部分内容片段
基于反向遗传学的假病毒系统
反向遗传学系统是突变研究的重要工具，它允许在实验室条件下构建自主的病毒颗粒系统。该系统涉及将编码病毒骨架和目标基因的质粒共转染到包装细胞中（图1A）。质粒组装成假病毒颗粒，然后可以收集这些颗粒用于功能分析（Shukla等人，2024年）。此外，假病毒通常具有较低的滴度。因此，它们可以
迷你基因组系统
反向遗传学系统能够研究病毒基因组中的突变，包括参与进入、复制和组装的蛋白质中的突变。相比之下，迷你基因组系统专注于复制和转录，而不产生感染性颗粒，主要针对非结构蛋白和选定的结构蛋白。是否包含结构蛋白取决于其功能是否可以与病毒颗粒的形成分离。需要膜整合或更高层次结构的蛋白质表面展示技术
低通量方法无法满足大规模突变研究的需求。表面展示技术通过实现病毒蛋白的高通量和可控筛选来克服这一限制，同时保持其天然构象（Taylor和Starr，2024年）。根据载体和应用方式，展示系统通常分为四种类型：噬菌体展示、细菌展示、酵母展示和哺乳动物细胞展示（图2A）。深度突变扫描技术
DMS能够系统地、定量地探索病毒蛋白的进化景观（Fowler和Fields，2014年）。DMS通常包括三个主要步骤（Starr等人，2020年）。它通过构建一个覆盖所有位点的饱和突变文库来实现这一点。然后将该文库与高通量表型检测（如假病毒感染性和抗体逃逸）结合，以识别可能推动病毒进化的突变（Xia等人，2023年）（图2B）。尽管DMS依赖于
基于硅和人工智能的分析平台
将进化方法与计算机模拟分析相结合，可以优先考虑可能出现的或促进感染的突变。我们介绍了几种基于硅的计算和人工智能驱动的平台，用于预测病毒突变和流行趋势，旨在为相关研究提供参考（表3）。早期研究表明，结合系统发育树、核苷酸替换和分子钟模型的方法可以估计突变率、概率等讨论
理解推动病毒进化的力量对于预测和缓解未来的疫情至关重要。病毒适应不仅仅是自发突变的结果，还受到选择压力的深刻影响，例如宿主免疫力（Dejnirattisai等人，2021年）、抗病毒药物抗性（Kabinger等人，2021年）、疫苗接种（Washizaki等人，2022年）和受体利用（Yao等人，2025年）。这些力量共同决定了病毒的进入能力和复制能力
资助与致谢
我们感谢国家自然科学基金（项目编号：32570068）、湖南省自然科学基金（项目编号：2024JJ2046）以及湖南省科技创新计划（项目编号：2023RC3169）的支持。
CRediT作者贡献声明
黄彦峰：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、形式分析、概念构思。欧志英：撰写——初稿、可视化。薛曦：撰写——审稿与编辑。周慧玲：撰写——审稿与编辑。肖康鹏：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念构思。
