含2'-脱氧硫代鸟苷的寡DNA双链体的化学与光诱导链间交联：一种新型可逆二硫键交联策略及其在核酸纳米技术中的应用

《Communications Chemistry》：Chemical and photoinduced interstrand crosslinking of oligo DNA duplexes containing 2′-deoxythioguanosines

本研究针对核酸链间交联效率与可控性不足的难题，开发了一种在寡DNA双链体中非互补位点精准定位2'-脱氧硫代鸟苷(TG)的新策略。通过化学氧化(碘)或365 nm紫外光照射，可实现高效二硫键交联（产率>90%），且交联产物可通过还原剂(DTT)可逆解离。该设计通过分子建模优化硫原子空间取向，使交联过程仅需微小构象调整，显著提升热稳定性(Tm>80℃)。研究进一步阐明光诱导交联通过单电子转移(SET)和硫基自由基(TG•)中间体实现，并证实超氧阴离子(O2•?)为关键副产物。该策略为动态DNA纳米结构构建、基因调控及靶向递送提供了新工具。

　　

在生命科学的前沿领域，核酸分子的精准操控一直是科学家们追求的终极目标之一。DNA双链通过沃森-克里克碱基配对实现的高度特异性识别，使其成为构建纳米结构、开发治疗剂和研究生物过程的理想材料。然而，传统DNA杂交形成的双链结构存在一个固有弱点——它们会遵循热力学原则可逆地解离，这种不稳定性严重限制了其在高温环境或复杂生物体系中的应用。

为了克服这一局限，研究人员将目光投向了链间交联技术。通过在不同链间引入共价连接，可以显著增强DNA双链的热稳定性和抗酶解能力。在众多交联策略中，二硫键因其独特的性质而备受关注：在生理条件下相对稳定，可被细胞内还原环境特异性切断，且能够响应氧化还原状态变化实现可逆组装。这些特性使其在药物递送、纳米机器构建和酶机制研究中展现出巨大潜力。

早期研究主要通过将硫修饰的核苷（如4-硫代尿苷(4SU)或6-硫代鸟苷(6SG)）放置在双链的互补位置来实现交联。但这种方法存在明显局限性——不仅交联效率受限，还需要金属离子辅助或特定序列环境。更关键的是，这些策略大多依赖于互补碱基配对，缺乏设计灵活性，且难以实现快速、可控的交联反应。

正是在这样的研究背景下，日本东北大学（Tohoku University）的研究团队在《Communications Chemistry》上发表了一项创新性研究，提出了一种全新的交联设计策略。他们巧妙地将两个2'-脱氧硫代鸟苷(TG)残基嵌入DNA双链的非互补但空间邻近位置，实现了在化学氧化和光诱导条件下的高效二硫键交联。

关键技术方法概述

本研究通过固相寡核苷酸合成将2'-脱氧硫代鸟苷磷酰胺单体嵌入特定序列，经高效液相色谱(HPLC)纯化后通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)验证序列。交联反应采用碘氧化(100μM)或365 nm紫外光照射(3.0 W/m²)诱导，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析效率。交联产物经酶切后通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)鉴定二硫键结构。热稳定性通过紫外熔解温度(T_m)测定，构象变化通过圆二色(CD)光谱分析。超氧阴离子(O₂^•?)生成采用硝基蓝四氮唑(NBT)法检测。

交联设计与反应效率

研究团队通过分子建模精心设计了TG残基的空间排列，使两个硫原子在双链中保持适宜距离（约4.27 ?）。这种"预组织"设计极大降低了交联所需的活化能。

化学氧化交联实验显示，在碘存在下，交联反应1分钟内即可完成，效率高达95%。更令人惊喜的是，在365 nm紫外光照射下，仅需10秒就能实现93%的交联产率，展现出卓越的光控特性。

反应可逆性与结构验证

交联产物经还原剂DTT处理后完全解离，证实了二硫键的本质。酶切实验和质谱分析进一步确认产物为二硫键连接的鸟苷衍生物，分子量与理论值完全匹配([M+H]⁺计算值565.1394，实测值565.1381)。

热稳定性分析显示，交联双链的熔解温度(T_m)从非交联状态的46℃跃升至80℃以上，证明共价连接极大增强了结构刚性。CD光谱表明交联后B型DNA特征信号增强，说明交联引起了轻微的螺旋构象调整。

位置与取向依赖性机制

深入研究揭示了交联效率对TG残基空间取向的高度依赖性。当保持原始取向但改变序列位置时，交联效率保持不变；然而，当TG取向相反时，交联效率显著下降，主要生成DTT抵抗的副产物。

分子建模表明，原始设计中TG残基的初始键角(约111.1°)与交联后状态(约105.15°)接近，仅需约6°调整；而反向设计需进行约16°的大幅构象重排，显著提高了反应能垒。

光诱导交联机制解析

光诱导交联机制研究表明，该过程通过单电子转移(SET)启动：激发态三重态TG(³TG)作为电子受体，基态TG(⁰TG)作为电子给体，产生TG^•?和TG^•+自由基对。在氧气存在下，TG^•?将电子转移给氧气生成O₂^•?，而TG^•+经去质子化形成硫基自由基(TG•)，最终形成二硫键。

无氧条件下交联效率大幅降低，证实氧气在驱动反应中的关键作用。NBT实验检测到O₂^•?生成，且双链系统中的生成速率显著快于单链系统，证明双链结构通过邻近效应促进了电子转移。

应用拓展与生物相关性

研究还成功将该策略应用于72碱基茎环结构的分子内交联，展示了方法的普适性。交联产物在细胞裂解液中可被快速还原，表明其具有良好的生物环境响应性。可逆交联实验显示，体系可经历至少三次连续的氧化-还原循环而无明显效率损失。

研究意义与前景

这项研究不仅提供了一种高效、可控的核酸交联新方法，更重要的是阐明了分子取向对反应效率的决定性影响，为理性设计核酸共价修饰提供了重要理论指导。这种光控二硫键交联策略在动态DNA纳米结构、基因沉默工具开发以及靶向药物递送系统等领域具有广阔应用前景，特别是其快速响应性和生物环境可逆性，为精准调控核酸结构和功能提供了新可能。

通过将基础化学原理与精巧的分子工程相结合，Jamila Abbas Osman、Kazumitsu Onizuka等研究者成功跨越了从概念设计到实际应用的鸿沟，为核酸化学生物学领域贡献了一个强大而灵活的新工具。随着后续研究的深入，这种基于硫代鸟苷的交联技术有望在纳米医学、合成生物学和化学生物学等多个领域发挥重要作用。