高通量测序技术替代生物制品外源病毒常规检测方法的评估研究

《npj Vaccines》：Evaluation of high-throughput sequencing for replacing the conventional adventitious virus detection assays used for biologics

本研究针对生物制品安全性检测中传统体外和体内病毒检测方法的局限性，探索了高通量测序(HTS)技术的替代潜力。研究人员通过在CHO细胞收获液中添加呼吸道合胞病毒(RSV)和哺乳动物正呼肠孤病毒(Reo1)，系统比较了HTS与常规检测方法的灵敏度。结果表明，HTS可有效检测复杂基质中的病毒，支持其替代体内检测方法，并有望补充或替代部分体外检测，为生物制品安全性评估提供了新策略。

　　

在生物制药领域，确保生物制品（如疫苗、单克隆抗体等）不受外源病毒污染是至关重要的安全性问题。传统上，监管机构要求采用体外细胞培养法和体内动物实验法来检测这些潜在污染物。然而，这些方法存在明显局限：体内实验需要使用大量动物，耗时长达数周，且伦理争议日益凸显；而体外检测虽较为常用，但对未知病毒或难以培养的病毒检测能力有限。历史上曾发生过多起引人深思的污染事件，例如在已上市轮状病毒疫苗中发现猪圆环病毒1型(PCV1)，以及用于杆状病毒表达系统的昆虫细胞系中发现新型弹状病毒，这些污染均未被当时的常规检测方法所发现，凸显了现有检测体系的漏洞。

随着测序技术的飞速发展，高通量测序(HTS)技术为病毒检测带来了革命性的希望。该技术能够无偏倚地检测样品中所有核酸序列，理论上无需预先了解病毒信息即可发现已知乃至全新的病毒，展现出替代传统方法的巨大潜力。然而，HTS技术在复杂生物制品基质（如含有高浓度宿主细胞蛋白和核酸的未纯化收获液）中的检测灵敏度、不同实验室间的结果可比性，以及其与传统方法的性能对比如何，仍是亟待回答的关键问题。为此，发表在《npj Vaccines》上的这项研究开展了一项精心设计的比对研究，旨在直接评估HTS替代常规病毒检测方法的可行性。

为开展此项研究，研究人员组成了包括美国FDA、Millipore Sigma、GSK等机构在内的国际合作团队。他们选择在中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞表达的未纯化收获液这一复杂基质中，掺入已知滴度的人类呼吸道合胞病毒(RSV)和哺乳动物正呼肠孤病毒1型(Reo1)作为模型病毒。这两种病毒分别代表单链RNA和双链RNA病毒，且预期能在常规检测中产生阳性结果。研究通过预实验确定了一系列病毒掺入水平，并制备了单次使用的盲样样本，分发给三个实验室（Lab 1, Lab 2, Lab 3）进行平行测试。研究采用的关键技术方法包括：样本的预处理（如低速离心澄清、冻融裂解）、核酸提取（酚氯仿法或硅胶柱法）、 ribosomal RNA (rRNA) 去除（部分实验室）、cDNA合成与测序文库构建、以及基于Illumina NovaSeq 6000或NextSeq 500/550平台的高通量测序。数据分析则采用了靶向分析（针对RSV和Reo1参考基因组）和非靶向分析（使用参考病毒数据库RVDB）两种生物信息学流程。同时，两个实验室（Lab 2和Lab 3）按照药典指南进行了为期28天的体外细胞培养检测（使用MRC-5、Vero和CHO-K1细胞系，观察细胞病变效应CPE、血吸附HAD和血凝HA），另一个实验室（Lab 3）还进行了体内动物实验（使用乳鼠、成年小鼠和鸡胚）。此外，数字滴度PCR (ddPCR) 被用于准确定量病毒基因组拷贝数(GC/mL)和验证体内实验样本。

Characterization of viruses and CHO-K1 cell matrix

研究人员首先对使用的RSV和Reo1病毒试剂以及CHO-K1细胞基质进行了充分表征。病毒提供了明确的感染滴度（TCID₅₀/mL）和基因组拷贝数(GC/mL)。CHO细胞收获液则测定了总蛋白、宿主细胞蛋白(HCP)、DNA含量等，并确认无支原体、细菌和真菌污染，为后续实验提供了可靠的背景信息。

Pre-study to identify test samples

预研究通过体外感染性试验和ddPCR检测了一系列病毒稀释样品，旨在确定用于正式头对头比较研究的测试样本。根据结果，最终选择了未掺毒样本A以及不同稀释度的样本C至H用于RSV和Reo1的HTS和体外检测比较。对于体内实验，则基于初步结果选择了最高掺毒水平的RSV样本B和一系列Reo1样本（B-H），以最大限度减少动物使用。

Evaluation of virus detection in spiked study samples

HTS analysis for virus detection

三个实验室使用各自的HTS工作流程和生物信息学分析流程对样本进行了检测。对于RSV，三个实验室通过靶向分析检测到病毒的灵敏度范围在1.04 x 10³至 1.04 x 10⁵GC/mL之间；对于Reo1，灵敏度范围在1.40 x 10⁴至 1.40 x 10⁶GC/mL之间。实验室间检测灵敏度的差异（可达2个数量级）可能与样本预处理方式（如是否澄清细胞碎片）、核酸提取方法、是否进行rRNA去除、测序平台、测序深度以及生物信息学分析中的阳性判断标准（如所需的最少读长数、覆盖度要求）等因素有关。非靶向分析的灵敏度通常略低于或等同于靶向分析。尽管如此，所有参与实验室均能在高宿主细胞背景的复杂基质中检测到RSV和Reo1。

In vitro infectivity analysis.

体外细胞培养检测结果显示，两个参与实验室（Lab 2和Lab 3）均能通过CPE检测到RSV和Reo1。Lab 2检测RSV的灵敏度更高（低至1.08 x 10^-1TCID₅₀/mL），而Lab 3检测Reo1的灵敏度在不同细胞系上表现一致。值得注意的是，实验室间在特定细胞系上检测病毒的灵敏度存在差异，例如Lab 3在CHO-K1细胞上未检测到RSV引起的CPE，而Lab 2则可以。这反映了常规生物学检测方法固有的变异性。

In vivo results

体内动物实验的结果凸显了其局限性。RSV在所有测试的动物模型（乳鼠、成年小鼠、鸡胚）中均未被检测到。Reo1在成年小鼠和鸡胚中也未引发阳性结果。仅在乳鼠模型中，在Reo1较高浓度接种的样本（B至F）的初次传代中观察到了临床症状（如毛发粗糙、腹部肿大等），提示感染。然而，在盲传（二次传代）后，除样本C外，其他样本均未再现临床症状。通过RT-ddPCR对乳鼠组织匀浆液进行检测，证实了Reo1 RNA的存在，说明临床症状确由病毒感染引起，但也表明可能存在不表现临床症状的感染（如样本G和H）。

Comparison of HTS, in vitro and in vivo assays for virus detection

本研究对HTS、体外和体内病毒检测方法进行了系统比较。结果表明，HTS和体外检测法对RSV和Reo1的检测灵敏度均显著高于体内检测法。复杂的基质对基于核酸检测的HTS技术存在一定影响，但这并未显著影响所选病毒在生物学检测法（体外）中的表现。HTS技术的突出优势在于其广谱性，能够检测未知病毒，且检测周期（数周）远短于传统方法（一月或更久）。然而，不同实验室间HTS检测灵敏度的差异也提示，该技术仍需进一步优化和标准化，例如在样本前处理、rRNA去除、使用内参对照等方面建立标准操作程序(SOP)。此外，HTS检测到的病毒核酸信号需要后续实验（如细胞培养）来确认是否存在具有感染性的完整病毒。

综上所述，这项由多机构合作完成的研究有力地证明，高通量测序(HTS)技术在检测生物制品中潜在的外源病毒污染方面，其灵敏度可与传统的体外细胞培养法相媲美，并显著优于体内动物实验法。研究结果支持当前ICH Q5A(R2)指南中的建议，即考虑采用HTS替代体内动物实验用于外源病毒检测，这符合全球推行的3R（减少、优化、替代）原则。更重要的是，凭借其强大的、无需预设的病毒检测能力，HTS不仅有望替代体内实验，未来还可能补充甚至替代部分体外检测，为生物制品的病毒安全性评估提供一种更快速、更全面且更人性化的解决方案。尽管HTS技术的标准化和灵敏度仍有提升空间，但本研究为其在生物制药行业监管和应用中的进一步推广提供了重要的实证依据，标志着生物制品安全性检测迈向了一个新的阶段。