从Inula racemosa中优化提取、分离和鉴定生物活性倍半萜类化合物的方法

《Bioorganic Chemistry》：Optimized extraction, isolation and identification of bioactive sesquiterpenes from Inula racemosa

超声波辅助提取工艺优化及单萜烯类成分活性研究|

　　

周文豪|蔡一杰|王希磊|涂一军|江洁娟|余建青

武汉大学药学院中南医院药学系，中国武汉430071

摘要

阿兰托拉酮（AL）和异阿兰托拉酮（IAL）是Inula racemosa Hook. f.中的生物活性成分，在这种草药中占有重要比例。由于这两种化合物具有广泛的生物活性，它们被广泛应用于制药、化妆品、农业等领域，展现出显著的市场潜力。然而，目前它们的获取主要依赖于传统中药，因此有必要优化提取工艺。此外，由于AL和IAL含量较高，次要成分（尤其是倍半萜类化合物）常常被忽视，导致其化学成分尚未完全明确。本研究开发了一种高效液相色谱（HPLC）检测方法，并通过响应面法（RSM）优化了超声辅助提取工艺，得到了最佳参数：液固比为15.34:1，乙醇浓度为88.92%，提取温度为49.21℃。为了鉴定次要成分，采用了基于特征的分子网络（FBMN）、网络注释传播（NAP）和ClassyFire技术。结果发现，次要倍半萜类化合物仍占较大比例。系统分离共得到了22种倍半萜类化合物，包括3种新化合物（1–3）和19种已知化合物（4–22）。生物活性评估表明，某些化合物对HepG2、SKOV3和HeLa细胞的细胞毒性比AL和IAL更强，其中化合物14通过诱导细胞凋亡表现出最佳的细胞毒性。此外，有4种化合物与顺铂（CDDP）联合使用时对SKOV3细胞具有协同作用。化合物14和15显示出强抗炎作用，半数有效浓度（IC₅₀）低于3μM。这些发现表明，被忽视的部分仍含有具有生物活性的倍半萜类化合物，值得进一步探索。

引言

阿兰托拉酮（AL）和异阿兰托拉酮（IAL）是一类含有α, β-不饱和羰基结构的倍半萜内酯，主要分布于Inula属植物中[[1], [2], [3]]。这些草药具有健脾养胃、调节气机以缓解抑郁、抗痉挛和降低血压的作用，在中国民间长期被用于治疗多种疾病[4]。它们的传统应用主要归因于AL和IAL的抗炎活性，最新研究表明AL可以直接结合NLRP3的NACHT结构域发挥抗炎作用，而α, β-不饱和羰基的双键是关键因素[5]。此外，许多药理学研究表明AL和IAL具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗衰老和杀虫作用[[6], [7], [8]]。值得注意的是，Inula racemosa Hook. f>中这两种化合物的含量非常高，使其在制药、化妆品、香料和农业产业中具有显著的商业潜力。因此，研究AL和IAL的提取工艺具有重要意义。

除了这两种主要生物活性化合物外，I. racemosa中还发现了一些次要倍半萜类化合物，如异阿洛阿兰托拉酮、inunolide和racemolactone I。此外，该植物中还含有脂肪酸、三萜类、黄酮类和木脂素[1]。然而，目前对I. racemosa中次要成分的研究还不够充分。幸运的是，全球天然产物社会分子网络（GNPS，网址：https://gnps.Ucsd.edu/）这种基于质谱的技术有助于研究人员快速了解样品的化学信息[9]。基于特征的分子网络（FBMN）是一种计算方法，将多种质谱处理工具与GNPS上的分子网络分析相结合[10]。网络注释传播（NAP）通过结构相似性在邻居之间重新排序候选化合物，即使没有实验库匹配[11]。ClassyFire是一个在线工具和数据库，可以将化合物分类为不同的化学类型[12]。所有这些现代技术可以结合起来，帮助阐明传统中药的化学组成。

现有研究表明，α, β-不饱和羰基结构是AL和IAL生物活性的关键基团[[13], [14]]。然而，在工业生产过程中，通常需要较高的生产条件和成本，如回流提取或超临界流体提取，这些方法会导致结构单元发生变化，从而显著降低其生物活性[15]。因此，在提取和分离过程中避免高温高压条件非常重要。

在本实验中，采用超声辅助提取方法研究了液固比、乙醇浓度、超声温度和超声时间对I. racemosa中AL和IAL提取率的影响。此外，通过响应面法（RSM）优化了提取工艺，旨在开发一种高产率、操作简单且效率高的提取方法。同时，创新性地结合了FBMN、NAP和ClassyFire技术来阐明I. racemosa的次要成分，尤其是倍半萜类化合物。随后进行了系统分离和纯化，获得了多种倍半萜类化合物，并进一步评估了它们的细胞毒性和抗炎活性。

实验部分

化学和生物试剂

HepG2、SKOV3、HeLa三种肿瘤细胞以及小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7）来自中国类型培养中心（武汉）。脂多糖（LPS）和细胞计数试剂盒-8（CCK8）购自Sigma（上海）和Beyotime（上海）。顺铂和吲哚美辛购自Aladdin（上海）。依托泊苷购自成都韦克奇生物科技有限公司。

植物材料

I. racemosa采集自...

HPLC分析及标准曲线绘制

通过超声辅助方法从I. racemosa中提取倍半萜类化合物，并通过HPLC进行分析。在标准溶液中，峰1和峰2分别被鉴定为IAL和AL（图1A）。在样品溶液中也能清晰地识别出这两种化合物（图1B）。制备了一系列不同浓度的标准溶液，以峰面积为纵轴，标准曲线显示在...

结论

为了从I. racemosa中提取具有生物活性的倍半萜类化合物，本研究首先开发了一种HPLC方法来定量主要成分AL和IAL。随后，通过Box-Behnken响应面实验确定了倍半萜类化合物的最佳提取条件，为工业生产提供了高效便捷的参考。此外，FBMN和NAP分析表明提取物中含有多种不同碳骨架的倍半萜类化合物，并预测了55种潜在成分

作者贡献声明

周文豪：撰写初稿、研究设计、概念构思。蔡一杰：研究。王希磊：研究。涂一军：研究。江洁娟：研究。余建青：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金申请、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32270409）的资助。