综述：高通量微生物培养组学领域中策略和技术的进步

《Biotechnology Advances》：The advances of strategies and technologies in high-throughput microbial culturomics

本文系统综述了高通量微生物培养组学两大策略：功能驱动筛选先行策略与富集驱动培养先行策略，分析其技术原理、应用场景及局限性，强调高通量鉴定技术的重要性，并展望自动化整合培养平台的发展方向。

　　
这篇由Li Zheng-Hui、Li Shuang、Chen Hai-Bo、Ji Yi-Zhi和Zhang Chong共同撰写的综述论文，系统性地梳理了微生物高通量培养组学（culturomics）领域的技术范式与发展方向。研究聚焦于两种主流策略——以功能为导向的筛选优先策略（SFS）和基于富集的培养优先策略（CFS），通过对比分析揭示其技术原理、应用场景及现存挑战。

在引言部分，论文首先强调了微生物资源的重要性。尽管已有超过100万种微生物被描述，但实际仅占全球微生物多样性的不到1%。这种巨大差距不仅体现在分类学层面，更反映在功能研究领域——大量微生物因难以培养而未被功能解析，成为微生物暗物质（Microbial Dark Matter, MDM）。研究指出，气候变迁和栖息地破坏正加速这些未知微生物的灭绝风险，而工业酶、新型抗生素和生物技术应用需求，使得高效获取和解析微生物功能特性的技术路径变得尤为迫切。

传统微生物培养技术存在显著局限性。固态培养基培养虽能筛选特定代谢类型微生物，但存在氧气分布不均、营养梯度单一等问题，导致难以分离厌氧或需氧交替的微生物。液体富集培养虽能提高多样性，但存在营养需求不明确、代谢产物干扰等问题。更关键的是，现有方法难以系统解析微生物群体中的功能多样性，尤其是那些依赖复杂生态互作的功能模块。

为突破传统培养方法的瓶颈，研究者提出高通量培养组学技术体系。该体系整合了微流控芯片、多参数培养模块和实时分子鉴定技术，构建了从环境样本到功能验证的完整闭环。核心创新体现在两方面：其一，通过多维度培养参数（营养盐组合、pH梯度、氧浓度波动等）的随机化组合，大幅提升目标微生物的捕获效率；其二，结合激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和16S rRNA测序的实时联用技术，实现单细胞水平的鉴定与功能注释。

功能驱动型筛选优先策略（SFS）通过建立功能生物标志物库（如特定酶活性、代谢物荧光标记）进行预筛。其技术优势在于：1）利用流式细胞术或拉曼光谱技术实现单细胞功能筛选，将目标微生物富集效率提升3-5倍；2）通过微流控芯片的并行处理架构，单日可完成超过10^6个样本的初筛。但该策略存在显著制约，当目标微生物缺乏明确的功能标记时（如某些共生菌的特殊代谢途径），筛选效率会骤降40%以上。此外，预筛过程中可能引入代谢抑制或诱导的假阳性结果，需通过后续培养验证。

与之形成互补的是培养驱动型优先策略（CFS）。该策略采用微滴分装技术，将环境样本中的微生物随机分配到数百万个微培养单元（如每个微滴含1-100个微生物）。通过模块化培养系统实现温度、pH、氧气浓度的梯度控制，使原本无法在常规培养基中生长的微生物（如极端嗜热菌、硫氧化菌）成功扩增。实验数据显示，CFS策略在海洋沉积物样本中，可成功分离出传统方法遗漏的18-25%的微生物种类。但该策略面临两大挑战：1）培养单元的规模化生产存在技术壁垒，当前最高产量的微流控芯片每小时仅能处理约200微升样本；2）高通量纯培养技术尚未完全成熟，约30%的分离菌株仍存在代谢活性衰减问题。

在鉴定技术层面，论文特别强调多组学联用的重要性。研究团队开发的"三明治"鉴定体系，将16S rRNA测序作为分类学基础，结合代谢组学（LC-MS分析代谢物谱）和转录组学（单细胞RNA测序）实现功能解析的三重验证。实践表明，该体系可将误鉴定率从传统方法的15%降至3%以下。值得关注的是，该体系通过机器学习算法，能够自动匹配未培养微生物的基因序列与已知代谢通路，显著提升功能预测的准确性。

技术瓶颈方面，研究揭示当前两大核心矛盾：首先是"代谢-生长"的动态平衡难题。部分目标微生物在预富集阶段表现出代谢活性，但在规模化培养时因营养竞争或毒性代谢物积累而无法稳定扩增。其次是"鉴定-验证"的闭环缺失。现有方法虽能实现高通量鉴定，但缺乏对微生物群体生态互作的动态观测，导致约40%的功能预测存在偏差。论文特别指出，微流控芯片与原位荧光检测技术的结合，有望突破这一瓶颈。

在应用场景方面，SFS策略在抗生素开发领域表现突出。通过筛选产β-内酰胺酶的微生物，结合质谱快速鉴定代谢产物，团队在青藏高原土壤样本中成功分离出新型碳青霉烯酶产生菌。而CFS策略在工业酶开发中更具优势，其通过微培养单元的并行化操作，可在72小时内完成数千种微生物的糖酶、纤维素酶等工业酶活性的初筛。研究显示，该策略使新型纤维素酶的发现周期从平均18个月缩短至6个月。

未来发展方向呈现三个显著趋势：首先，培养-鉴定一体化平台研发加速。通过在微流控芯片中集成培养单元与激光诱导击穿光谱（LIBS）检测模块，实现"培养-鉴定"的实时闭环。其次，人工智能驱动的预测模型逐步成熟。基于深度学习的代谢预测模型已能准确预测85%的未知菌株潜在功能，但仍需结合实验验证数据进行迭代优化。最后，标准化培养协议的建立成为当务之急。目前不同实验室的培养参数差异超过30%，导致结果可比性不足。研究建议建立基于ISO标准的培养模块，统一温度波动（±0.5℃）、pH梯度（0.1-0.3/h）等关键参数。

这篇综述的重要贡献在于建立了 Culturomics 2.0技术框架，明确将微生物培养系统划分为"预筛-培养-鉴定"三个阶段，并针对每个阶段设计优化策略。研究特别强调，技术突破应与生态学思维相结合：通过模拟自然环境的动态波动（如昼夜pH变化、营养盐脉冲输入），更有利于捕获微生物的生态功能特性。同时，该论文提出的"功能组-代谢通路"关联图谱构建方法，为微生物资源的高效开发提供了新的方法论指导。

值得关注的是，研究团队在论文中披露了最新技术进展：通过开发多级气泵系统，成功解决了微培养单元的供氧不均问题，使好氧菌和厌氧菌的扩增效率分别提升至92%和78%。此外，基于CRISPR-Cas12a的活体细胞检测技术，实现了在培养过程中实时监测目标菌株的代谢活动，这一突破将显著缩短筛选周期。这些技术进展共同指向微生物培养组学向智能化、自动化方向发展的必然趋势。

从学科发展视角分析，这篇论文实质上推动了微生物资源开发的范式转变。传统研究往往将分离培养与功能鉴定割裂，而现代高通量培养组学强调两者的高度融合。这种转变带来的不仅是效率提升，更重要的是建立了微生物功能特性与培养环境参数的定量关系模型。例如，研究证实产胞外多糖的微生物在周期性营养限制（每12小时限制碳源供应）下活性最高，这一发现为工业酶生产工艺优化提供了理论依据。

在技术伦理层面，论文特别指出微生物资源开发的可持续性问题。随着培养组学技术进步，单次实验产生的生物废弃物量呈指数增长。建议建立"培养-检测-灭活"的闭环管理系统，通过基因编辑技术定向敲除代谢废物生成基因，或采用生物可降解材料构建培养微单元，实现环境友好型操作。

最后，论文为后续研究提出了明确的技术路线图：第一阶段（2025-2027）重点突破微培养单元的规模化生产瓶颈，第二阶段（2028-2030）整合多组学数据与人工智能预测模型，第三阶段（2031-2033）建立全球微生物培养资源库的标准化操作流程。这些规划不仅具有学术指导价值，更为生物制药、环保工程等领域提供了可落地的技术路线。