通过长读长RNA测序技术，揭示了1型糖尿病（DM1）成纤维细胞中转录组范围内的异构体及启动子重塑现象

《Genomics》：Transcriptome-wide isoform and promoter remodeling in DM1 fibroblasts uncovered by long-read RNA sequencing

肌强直性肌营养不良症1型（DM1）成纤维细胞存在转录起始调控异常（106个差异调控启动子）和异构体开关事件（104个），显著影响细胞骨架重塑、外源性基质受体相互作用及 longevity信号通路。其中替代第一外显（AF）事件占比达90%，且主要发生在未注释基因中，而 skipped exon（SE）事件在已注释基因中更为显著。这些异构体层面的重编程独立于基因表达水平变化，揭示了DM1疾病机制的多层次调控特征。

　　
本研究针对肌强直性肌营养不良症1型（DM1）的转录组进行系统性解析，通过整合长读（PacBio Iso-Seq）与短读（Illumina RNA-seq）测序技术，首次在患者成纤维细胞中实现全转录本层面的精准检测。研究揭示了DM1疾病机制中由多维度转录调控异常驱动的复杂分子网络重构，为理解DM1的异质性表型提供了全新视角。

### 一、研究背景与核心问题
DM1是由DMPK基因3'UTR的CTG三核苷酸重复扩增引发的疾病，其病理特征包括RNA结合蛋白异常聚集导致的转录调控紊乱。尽管已有研究证实DM1存在广泛异源剪接（AS）异常，但传统短读测序技术难以解析全转录本结构，特别是未注释基因的异构体形成机制。本研究通过长读测序技术突破现有局限，系统探究DM1纤维细胞中转录起始位点的重排、剪接事件的异质性及未注释转录本的功能。

### 二、技术方法创新
研究采用PacBio Iso-Seq技术捕获完整转录本，结合Illumina RNA-seq进行高精度表达量验证。该技术组合的优势在于：
1. **长读能力**：PacBio可识别超过1.8kb的连续序列，精准解析首外显子选择（AF）、末端外显子选择（AL）等复杂剪接模式
2. **短读验证**：Illumina数据通过多平台交叉验证，确保高置信度的基因表达谱
3. **整合分析框架**：开发联合分析流程（SQANTI3+IsoQuant），实现从序列读数到功能注释的全链条解析

### 三、关键发现与机制解析
#### （一）转录起始位点重排
1. **未注释启动子激活**：DM1样本中72个显著调控的启动子（DRPs）属于新发现调控元件，占所有DRPs的68%
2. **功能重塑**：这些新启动子调控的基因多涉及细胞骨架（如ACTN1）、外基质重构（如COL1A1）等关键通路
3. **双重调控模式**：
- **协同调控**：49个DRPs与DEGs（基因表达差异）形成共调控网络，激活纤维化相关通路
- **解耦调控**：72个DRPs未伴随基因表达变化，提示启动子特异性调控的独立机制

#### （二）异源剪接事件特征
1. **事件类型分布**：
- 首外显子选择（AF）占比90%（1156/1289）
- 内含子保留（RI）和可变外显子（A3/A5）共占10%
2. **功能关联**：
- 肌肉相关基因（如TPM1、ACTN1）剪接异常导致蛋白结构改变
- 长寿调控基因（如FOXO1、PRKACA）出现特异性异构体
3. **调控机制突破**：
- **AF事件**与Fox转录因子家族（FOXP1/FOXP2/FOXP3）结合位点显著富集（p=0.0007）
- **SE事件**（外显子跳跃）在已注释基因中占主导，提示基础剪接元件的破坏

#### （三）未注释转录本的功能探索
1. **数量特征**：
- DM1样本识别出1.7万条新转录本（NNC类）
- 这些新转录本中83%具有完整开放阅读框（ORF）
2. **功能验证**：
- RT-PCR证实FOXO1-PB.10011.7等新转录本的特异性表达
- 结构预测显示TPM1异构体存在显著构象差异（ΔPSI=0.08，FDR<0.0001）

### 四、病理机制重构
#### （一）多层级转录调控异常
1. **表观遗传层**：CUG-RNA聚集导致RNA结合蛋白（CUGBP1/MBNL1）空间分布改变
2. **转录起始层**：新发现72个调控元件，其中41个位于非编码区
3. **剪接加工层**：1289个显著剪接事件，形成"剪接重排-蛋白功能异常-组织损伤"的级联效应

#### （二）关键通路异常解析
1. **寿命调控通路**：
- PRKACA基因表达下降50%，但新型异构体PB.17486.3/19激活促衰信号
- FOXO1 truncated isoform（缺失FHA结构域）导致DNA损伤应答缺陷
2. **细胞骨架重塑**：
- ACTN1剪接异常导致α-actinin蛋白稳定性下降
- TPM1异构体影响肌球蛋白相互作用
3. **外基质-受体信号**：
- COL1A1表达增加与纤维化相关
- GPR176（未注释基因）剪接改变影响机械感知

### 五、科学意义与临床启示
1. **机制突破**：
- 首次证实DM1中存在"启动子-剪接"协同调控异常
- 揭示未注释基因（如GPR176）在DM1中的潜在致病作用
2. **治疗靶点发现**：
- 新型剪接体（如FOXO1-PB.10011.7）可作为特异性药物靶标
- 转录起始调控元件（如72个DRPs）可能成为联合治疗靶点
3. **多组学整合价值**：
- 转录本层面数据为单细胞测序提供标准化流程
- 长读测序技术显著提升罕见突变检测灵敏度（达0.1% PSI变化阈值）

### 六、研究局限与展望
1. **样本局限性**：
- 仅分析皮肤成纤维细胞（n=5+4）
- 未覆盖心肌、肌肉等关键组织
2. **技术优化空间**：
- 需提高新转录本注释覆盖率（当前仅32%）
- 长读测序深度需进一步提升（当前FLNC reads≥5M）
3. **未来研究方向**：
- 建立患者特异性转录本图谱数据库
- 开发基于异构体精准调控的RNA疗法（如ASO或siRNA）
- 多组学整合分析（结合ATAC-seq、ChIP-seq）

### 七、总结
本研究通过技术创新实现了转录调控网络的精细化解析，揭示DM1患者纤维细胞存在"三级重构"：
1. **启动子层**：新调控元件激活（+17.3%基因使用多启动子）
2. **剪接层**：异构体重排频率增加（+5.8% ASE事件）
3. **翻译层**：新型异构体功能改变（如FOXO1 truncated isoform）

这些发现不仅完善了DM1的分子致病模型，更为精准治疗提供了新靶点：通过特异性调节转录起始（如新型启动子）或剪接事件（如关键基因的SE/MX调控），可能实现多系统症状的协同改善。该研究方法框架可推广至其他RNA相关疾病，为疾病机制研究提供标准化技术路径。