利用吸收和圆二色光谱技术揭示大肠杆菌细胞色素bd-I完全还原状态下与氰化物的可逆结合反应

《Biochemistry (Moscow)》：Examination of the Reaction of Escherichia coli Cytochrome bd-I in the Fully Reduced State with Cyanide Using Absorption and Circular Dichroism Spectroscopy

本刊推荐：为解决关于大肠杆菌细胞色素bd-I在完全还原状态下能否结合氰化物的学术争议，研究人员开展了针对膜结合与分离纯化酶形式的比较研究。通过吸收光谱和圆二色光谱技术，首次证实膜结合形式的完全还原bd-I氧化酶确实能够可逆地结合氰化物（Kd=81.1 mM），且一氧化碳可竞争性置换氰化物。研究还发现氰化物与血红素d2+的结合会显著减弱其与血红素b5952+之间的激子相互作用，这对理解bd型氧化酶的配体结合机制和耐药性具有重要意义。

　　

在微生物的能量代谢系统中，末端氧化酶扮演着将电子最终传递给氧气的关键角色。其中，细胞色素bd型氧化酶因其独特的结构和功能特性而备受关注。与常见的血红素-铜氧化酶超家族不同，bd型氧化酶不含铜离子，却含有三个血红素辅基：b₅₅₈、b₅₉₅和d。这种特殊的组成使其对多种环境压力因子如一氧化氮、过氧化氢、硫化氢以及本文关注的氰化物表现出显著的耐受性。更值得注意的是，编码bd型氧化酶的基因在人类基因组中不存在，这使得它成为开发新型抗菌药物的理想靶点。

然而，科学界对细胞色素bd-I与氰化物的相互作用存在长期争议。早前的研究认为，位于天然膜环境中的完全还原态bd-I氧化酶不能结合氰化物，甚至将此作为bd型氧化酶的鉴别特征。这一结论与近期对分离纯化酶的研究结果相矛盾，后者明确检测到了氰化物结合现象。这种分歧可能源于酶分子所处微环境的差异——膜结合形式处于天然脂质环境中，而分离纯化酶则处于去垢剂胶束中。膜环境已知能显著影响膜蛋白的结构和功能特性，包括配体结合能力。

为了澄清这一争议，俄罗斯莫斯科国立大学的Vitaliy B. Borisov和Alexander M. Arutyunyan在《Biochemistry (Moscow)》上发表了他们的最新研究成果。研究人员采用吸收光谱和圆二色光谱(CD)技术，系统比较了膜结合形式和分离纯化形式的大肠杆菌细胞色素bd-I在完全还原状态下与氰化物的相互作用。

研究团队使用缺失血红素-铜醌氧化酶bo3的大肠杆菌GO105/pTK1菌株，通过高压破碎法制备含有细胞色素bd-I的膜囊泡，并用蔗糖月桂酸单酯增溶后经DEAE-Sepharose Fast Flow柱纯化获得分离纯化酶。所有光谱实验在21°C厌氧条件下进行，使用含50 mM HEPES、50 mM CHES和0.5 mM EDTA(pH 8.0)的缓冲液，对分离纯化酶还添加了0.05%月桂酰肌氨酸钠。酶浓度通过还原态与氧化态差示光谱的毫摩尔消光系数(Δε_628-607=10.8 mM^-1·cm^-1)确定。

膜结合形式细胞色素bd-I与氰化物的反应

向连二亚硫酸钠还原的膜结合细胞色素bd-I添加氰化钾后，研究人员观察到了明确的谱学变化。差示吸收光谱显示，在可见光区域600nm处的吸收带发生蓝移，最小值位于634nm；在Soret区则出现了W形响应，最小值位于424nm和443nm。

这些变化与在分离纯化酶上观察到的结果相似，但与此前认为膜结合形式不能结合氰化物的研究结论相矛盾。研究人员推测，早期研究可能因膜样品中细胞色素bd-I含量较低或检测灵敏度不足而错过了这一相对微弱的信号(ΔA_600-633~0.015)。

通过分析吸收变化与氰化物浓度的关系，研究人员计算出膜结合形式酶与氰化物的表观解离常数K_d=81.1±7.8 mM KCN，比分离纯化酶的相应值(52 mM)高约1.5倍，表明膜环境确实影响了酶对氰化物的亲和力。

反应动力学特征

对反应动力学的分析显示，氰化物与膜结合bd-I氧化酶的结合遵循单指数函数规律，表明酶中只有一个配体结合位点。

二级速率常数k_on=0.11±0.01 M^-1·s^-1，与分离纯化酶的值(~0.1 M^-1·s^-1)非常接近，说明脂质环境对结合速率影响不大。这一速率远低于其他氧化酶如大肠杆菌细胞色素bo3(572 M^-1·s^-1)和牛心线粒体细胞色素c氧化酶(35-235 M^-1·s^-1)，可能部分解释了bd-I氧化酶对氰化物相对不敏感的原因。

一氧化碳与氰化物的竞争性结合

为了验证氰化物结合的可逆性以及CO和氰化物是否竞争同一结合位点，研究人员比较了在有和无氰化物条件下，CO对还原态bd-I氧化酶的滴定曲线。

结果显示，向预先与100mM KCN结合的还原酶添加CO后，绝对吸收光谱与未处理酶加CO得到的光谱几乎相同，表明CO能够置换氰化物，形成酶-CO复合物。然而，在100mM KCN存在下，使酶结合位点达到半饱和所需的CO浓度显著提高(膜形式：5.7±0.2μM vs 0.8±0.1μM；分离纯化形式：4.4±0.3μM vs 1.1±0.1μM)。这明确证明CO和氰化物竞争结合细胞色素bd-I的同一活性位点(血红素d²⁺)，且作为更强配体的CO在竞争中"胜出"。

氰化物对光学活性的影响

通过圆二色光谱，研究人员进一步探究了氰化物对还原态细胞色素bd-I光学活性的影响。还原酶的CD光谱在630nm处显示一个小的正信号，对应于血红素d²⁺的吸收最大值；Soret区则包含一个大的不对称信号，负带最小值在440nm，正极值在417nm，零交叉点在426nm。

氰化物的加入导致630nm处的正CD信号消失，同时Soret区的负CD信号减弱，负带最小值从440nm移至442nm，正极值从417nm移至410nm。差示CD光谱显示630nm处有最小值，437nm处有强正信号，422nm和453nm处有局部最小值。这些变化表明氰化物与血红素d²⁺的结合显著减弱了血红素d²⁺与血红素b₅₉₅²⁺之间的激子相互作用，这与吸收光谱中观察到的血红素b₅₉₅²⁺光谱变化相一致。

作用机制探讨

基于低温电子显微镜结构数据，研究人员提出了氰化物结合血红素d²⁺的可能机制。根据两个不同的结构研究，血红素d的轴向配体可能是His19或Glu99。如果CN^-与氧分子结合在血红素铁离子的同一侧，则氰化物与完全还原细胞色素bd-I中血红素d²⁺的结合可能有两种方式。

无论哪种情况，血红素d²⁺在与氰化物结合后仍保持五配位高自旋状态。对于CO与氰化物加合物的相互作用，研究人员认为CO可能导致氰化物解离，并与血红素铁离子在卟啉大环平面的同一侧结合，同时His19在平面另一侧与铁离子配位，形成六配位低自旋状态。

本研究系统解决了关于细胞色素bd-I在完全还原状态下能否结合氰化物的长期争议，明确证实无论是膜结合形式还是分离纯化形式，该酶都能可逆地结合氰化物。研究人员精确测定了结合参数，发现膜环境对结合亲和力有适度影响，但对结合速率影响不大。竞争实验证明CO能够置换氰化物，表明两者竞争同一结合位点(血红素d²⁺)。圆二色光谱研究首次揭示了氰化物结合对血红素d²⁺与血红素b₅₉₅²⁺之间激子相互作用的显著影响。

这些发现不仅澄清了学术争议，更重要的是增进了对bd型氧化酶配体结合机制的理解。细胞色素bd-I对氰化物的相对低亲和力和慢结合动力学可能与其对这类抑制剂的天然耐受性有关，这也是许多病原菌依赖bd型氧化酶在恶劣环境中生存的原因之一。鉴于bd型氧化酶在人类中不存在，针对这一酶系的深入研究将为开发新一代抗菌药物提供重要理论基础。