SEED-Selection技术实现多基因位点编辑T细胞的高效富集：推动复杂细胞疗法临床生产的突破

本研究针对当前T细胞疗法生产中部分编辑细胞异质性的难题，开发了名为SEED（合成外显子表达干扰器）的新型修复模板技术。通过将转基因整合与内源表面蛋白敲除耦合，研究人员建立了无需药物标记的一步式免疫磁珠负选系统（SEED-Selection），在TRAC、B2M和CD4三个关键位点实现高达90%纯度的六重编辑（三重敲入+三重敲除）。该技术兼容现有临床生产流程，为开发复杂基因编辑细胞疗法提供了标准化解决方案。

　　

在癌症免疫治疗领域，工程化T细胞疗法已经展现出革命性的潜力，特别是表达合成免疫受体（如CAR-T）的疗法在血液肿瘤治疗中取得显著成效。然而，当前技术面临两大瓶颈：一是多基因编辑时产生的细胞群体高度异质，含有大量部分编辑细胞；二是自体疗法个性化生产流程复杂昂贵。这些问题严重制约着细胞疗法的广泛应用和疗效提升。

美国加州大学旧金山分校和格拉德斯通基因组免疫学研究所的研究团队在《Nature Biotechnology》发表研究，开发出名为SEED-Selection的创新技术。该技术通过合成外显子表达干扰器（SEED）将转基因整合与内源蛋白表达缺失耦合，建立了一步式无标记富集系统。研究团队使用CRISPR-Cas9基因编辑结合腺相关病毒（AAV6）递送修复模板，在GMP兼容条件下对健康供体来源的原代T细胞进行多重编辑，并通过单细胞RNA测序和数字微滴PCR等技术全面评估基因组安全性。

关键技术方法包括：1）设计靶向TRAC、B2M和CD4基因内含子的sgRNA文库筛选；2）开发包含剪接元件和P2A序列的SEED修复模板；3）优化临床级电转染和AAV转导条件；4）建立多重免疫磁珠负选流程；5）采用单细胞RNA测序分析染色体异常。研究使用健康供体来源的原代T细胞和NK细胞进行功能验证。

【SEEDs enable enrichment of cells with transgene integrations】
研究团队首先靶向T细胞受体α恒定区（TRAC）和β₂微球蛋白（B2M）基因内含子设计gRNA，筛选出能高效产生双链断裂（DSB）但不影响蛋白表达的位点。通过SEED模板将CAR表达与TCR缺失耦合，免疫磁珠分选后获得纯度达92.6%的TCR^-CAR⁺细胞，而传统外显子靶向策略仅能达到50%纯度。这种内含子靶向策略显著减少了因大片段缺失导致的非编辑细胞。

【NHEJ inhibitors enable efficient biallelic SEED integration】
为克服非同源末端连接（NHEJ）优势竞争的问题，研究人员在B2M靶向实验中加入NHEJ抑制剂M3814。高剂量AAV（3×10⁵ MOI）联合抑制剂使双等位基因整合效率提升至83%，而低剂量（1×10⁴ MOI）时仍可检测到双等位编辑。免疫磁珠分选后，B2M^-CD47⁺细胞纯度超过98%，PCR证实非编辑等位基因被有效清除。

【SEED-Selection simultaneously enriches for multilocus edits】
在TRAC和B2M双位点编辑中，临床相关AAV剂量（2×10⁵ MOI）产生55%完全编辑细胞（TCR^-CAR⁺B2M^-CD47⁺）。优化后的G-REX培养系统使病毒用量减少85%（3×10⁴ MOI），仍能获得50%完全编辑细胞。放大至1.6×10⁸细胞规模的GMP生产验证了该策略的临床可行性，7天扩增后获得2.5×10⁹完全编辑细胞。

【Epitope-edited human leukocyte antigen-independent TCRs are compatible with SEED-Selection】
针对HLA非依赖型TCR（HIT）与抗TCR抗体（BW242/412）交叉反应的问题，研究团队通过饱和突变筛选发现Cβ亚基112位天冬氨酸（D112）是关键表位。将D112突变为赖氨酸（K112）的HIT受体在保持功能的同时，使BW242结合降至背景水平。TRAC靶向SEED分选后，HIT⁺细胞纯度达98%，且对低抗原密度肿瘤细胞的杀伤活性不变。

【Epitope-edited TCRs enable minimization of mispairing】
在NY-ESO-1特异性TCR（1G4-LY）工程化中，表位编辑（K112突变）可区分正确配对（dextramer⁺BW242^-）与错误配对（dextramer⁺BW242⁺）群体。单步分选即可去除98%的内源TCR和错误配对细胞，避免了传统TRAC/TRBC双敲除的复杂性。类似策略在MART-1靶向TCR（DMF5）中也得到验证。

【SEED enables simultaneous coreceptor and TCR swapping】
为解决CD4⁺ T细胞中MHC-I限制性TCR功能不足的问题，研究人员在CD4位点整合CD8α/β共受体。免疫磁珠分选获得98%纯度的CD4^-CD8⁺群体，使NY-ESO-1 dextramer结合显著增强。在A375黑色素瘤杀伤实验中，共受体表达使CD4⁺ T细胞活性提升至CD8⁺ T细胞水平。

【Multilocus low-MOI editing is efficient at clinical scale】
三重编辑（TRAC-1G4-LY^K112、B2M-CD47、CD4-CD8α/β）后，单步分选可获得90%纯度的完全编辑细胞。低MOI条件下，分选使完全编辑细胞比例从24%提升至70%。ddPCR检测显示平衡易位频率为0.1-1.9%，且SEED分选不会富集染色体异常细胞。单细胞测序证实染色体14（TRAC）的异常率（3.3%）高于12（B2M，0.02%）和15（CD4，1.1%）。

这项研究建立的SEED-Selection技术体系具有多重创新价值：其一，通过耦合基因编辑与表面标记缺失，实现了无标记、一步式多重编辑细胞富集；其二，表位编辑策略解决了治疗性受体与分选抗体的交叉反应问题；其三，GMP兼容流程验证了临床转化的可行性。该技术不仅适用于CAR-T和TCR-T疗法，还可扩展到干细胞编辑等领域，为通用型（off-the-shelf）细胞产品的标准化生产提供了全新解决方案。研究揭示的基因组安全数据也为临床级基因编辑提供了重要参考。