近红外 II 区 / 短波红外发光纳米颗粒平台构建新冠疫苗的创新探索

新冠疫情全球肆虐，有效疫苗至关重要。本文研发了基于近红外 IIb（NIR-IIb）发光的纯 NaErF4@NaYF4纳米颗粒（pEr）的新冠疫苗。该疫苗无需佐剂，能引发持久免疫反应，还可通过 NIR-IIb 成像评估免疫反应，为疫苗开发带来新方向。

　　### 引言
2019 年出现的新冠病毒（SARS-CoV-2）引发全球大流行，死亡人数众多。现有疫苗，如 mRNA 疫苗和蛋白亚单位疫苗，虽在抗疫中发挥作用，但存在各自弊端，如 mRNA 疫苗成本高、需超低温储存，亚单位疫苗免疫原性较低，常需佐剂增强免疫反应，且疫苗诱导的免疫力会随时间减弱，因此开发更高效、易获取、免疫反应持久的疫苗平台很有必要。

新冠病毒的刺突蛋白是疫苗主要靶点，其受体结合域（RBD）能独立识别受体，基于 RBD 的亚单位疫苗研究不断推进，展现出潜在应用价值。此前研究发现，近红外 IIb（NIR-IIb，1500 - 1700nm）发光的稀土铒基纳米颗粒（pEr）可作为癌症疫苗载体，利用 NIR-IIb 成像能实时观察疫苗在体内的运输和迁移。在此基础上，本文探索将 pEr 纳米颗粒用于传染病疫苗，构建了无需佐剂的新冠疫苗 pEr-P³-RBD。

结果

1. 疫苗载体 pEr 纳米颗粒的合成与成像特性：合成的 pEr 纳米颗粒由纯六方 β 相 NaErF₄核心和六方 β 相 NaYF₄外壳组成，平均直径约 26.8nm。975nm 激发时，在 1500 - 1700nm NIR-IIb 范围内有明亮的下转换发光，大斯托克斯位移使其具有近零组织自发荧光、抑制光散射和深层组织穿透能力，利于体内荧光成像。为提高生物相容性，对 pEr 纳米颗粒进行三层交联亲水聚合物（P³）包覆，形成 pEr-P³纳米颗粒，其水动力尺寸约 55.5nm，表面氨基用于偶联抗原。
2. pEr-P³-RBD 纳米疫苗的体内追踪：通过 EDC 化学法将 SARS-CoV-2 的 RBD 蛋白偶联到 pEr-P³纳米颗粒上，制备出 pEr-P³-RBD 纳米疫苗，偶联效率达 93.6%。将其皮下注射到小鼠尾基部，利用 NIR-IIb 成像发现，疫苗经淋巴管迁移到淋巴结（LN），注射后约 2 小时信号在引流腹股沟 LN（iLN）明显增强，24 小时达到峰值，同时也观察到迁移到腋窝 LN（aLN）。疫苗在注射部位的信号约 42 天逐渐减弱消失，表明其持续释放，且主要经肝 / 胆途径随粪便排出，未在尿液中检测到，组织病理学和血液生化检测显示该疫苗无明显短期和长期毒性。
3. 免疫后的体温和血清学反应：分别用 pEr-P³-RBD（WT）、pEr-P³-RBD（Omicron BA.1）和纯 RBD（WT）蛋白免疫小鼠，发现 pEr-P³-RBD 免疫组小鼠体温在免疫后有不同程度升高，表明其引发了较强免疫反应，且 pEr-P³-RBD（Omicron）组免疫反应更强。通过纳米等离子体金（pGOLD）检测发现，pEr-P³-RBD 免疫小鼠在初次免疫和加强免疫后，血清中抗 RBD IgG 抗体水平较高，且 7 个月后仍维持较高水平，而纯 RBD 蛋白免疫组抗体水平较低。
4. SARS-CoV-2 中和抗体反应：采用 SARS-CoV-2 假病毒中和试验检测疫苗诱导的中和抗体反应。结果显示，pEr-P³-RBD（WT）和 pEr-P³-RBD（Omicron BA.1）免疫小鼠在加强免疫 14 天后，血清对相应假病毒有较强中和活性，且存在一定交叉反应，而纯 RBD 蛋白免疫组几乎无中和活性。7 个月后，pEr-P³-RBD 免疫小鼠血清中和抗体活性进一步增强，这可能与疫苗的持续释放有关。
5. pEr-P³-RBD 免疫刺激的生发中心（GC）反应：为评估 pEr-P³-RBD 疫苗引发的免疫反应，用其免疫 C57BL/6 小鼠，分析 GC 相关免疫细胞。结果发现，免疫后 pEr-P³-RBD（WT）组小鼠 iLN 中 WT RBD 特异性 GC B 细胞、T 滤泡辅助细胞（T_FH）等免疫细胞百分比增加，且加强免疫后进一步升高，同时记忆相关免疫细胞也显著增加，表明疫苗能有效刺激 GC 反应，诱导长期免疫记忆。
6. RBD 特异性细胞的体内 NIR-IIb 分子成像：将 RBD（WT）与有机近红外染料 IR840 偶联，制备 IR840-RBD 探针，用于标记小鼠 LN 中的 RBD 受体。免疫小鼠后注射该探针，通过 NIR-II 成像发现，pEr-P³-RBD（WT）免疫小鼠 iLN 中 IR840-RBD 探针信号更强且持续时间更长，而 PBS 处理的对照组小鼠探针信号弱且迅速经肾脏排出，表明通过组织 NIR-II 分子成像可快速、无创地评估疫苗免疫反应。

讨论

本研究构建了基于 pEr-P³的新冠疫苗，引入了可追踪的红外发光疫苗用于传染病领域。NIR-II/SWIR 纳米疫苗平台有望用于指导疫苗配方设计、可视化疫苗体内运输、评估免疫反应并优化疫苗配方。

pEr-P³-RBD 疫苗能有效迁移到 LN，引发强而持久的免疫反应，其交联稳定的表面涂层、抗原的稳定固定以及疫苗向 LN 的易迁移性是高效免疫和持续刺激免疫系统的关键因素。该疫苗在无佐剂情况下，诱导的中和抗体滴度高于部分含佐剂的蛋白亚单位疫苗。

GC 反应对保护性免疫至关重要，pEr-P³-RBD 疫苗能诱导高水平的 RBD 特异性 GC B 细胞和 T_FH细胞，与高中和抗体产生密切相关。此外，体内非侵入性 NIR-II 分子成像为评估小鼠对疫苗和免疫疗法的免疫反应提供了新方法，有助于疫苗和免疫疗法的开发。

总之，本研究利用 NIR-II/SWIR 发光稀土纳米颗粒构建了新冠亚单位纳米疫苗，通过非侵入性 NIR-II 成像观察到疫苗的运输和免疫反应，pEr-P³纳米颗粒作为有效疫苗载体具有通用性，NIR-II/SWIR 纳米疫苗平台为疫苗开发开辟了新途径。