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本文开发了一种 T 细胞特异性数字 PCR（dPCR）检测方法，可与嵌合抗原受体 - T 细胞（CAR-T）及对照基因检测多重联用，能在单一反应中对 CAR-T 细胞、T 细胞和有核细胞进行定量，减少了实验步骤，为 CAR-T 治疗患者的免疫监测提供有力工具。
引言
嵌合抗原受体 - T 细胞（CAR-T）治疗已彻底改变了儿科和成人 B 细胞恶性肿瘤的治疗方式，并且在众多其他血液和实体肿瘤的早期临床试验中也在进行评估。CAR-T 细胞在患者体内的持久性是影响短期疗效和长期生存的关键因素之一 。
数字 PCR（dPCR）作为一种灵敏且操作简便的方法，在监测 CAR-T 细胞持久性方面备受青睐，它能适用于任何 CAR-T 构建体。然而，传统的 dPCR 对 CAR-T 细胞的定量方式，如以每微升拷贝数（copies/μL）或占总核细胞的百分比表示，并不能体现 CAR-T 细胞占总 T 细胞的比例。虽然流式细胞术可弥补这一不足，但许多 CAR 检测试剂灵敏度低、背景高，对操作人员的专业水平要求较高。因此，研究人员设计了一种新的 dPCR 检测方法，旨在实现对 T 细胞相对于总核细胞的定量，并且能与 CAR 特异性 dPCR 联用，从而减少样本量需求，为 CAR-T 治疗患者提供更有价值的临床信息。
结果
研究人员开发的 T 细胞受体（TCR）dPCR 检测方法，可与定制的 CAR 特异性 dPCR 检测以及白蛋白（ALB，HGNC:399）参考基因检测在 Qiacuity dPCR 仪器（QIAGEN）上进行多重检测。该检测方法能扩增具有种系 TCRα（TRA，HGNC:12027）位点的非 T 细胞，通过扩增的 TCR 每微升拷贝数与总核细胞（以白蛋白参考基因的每微升拷贝数表示）的比值，可计算出 T 细胞的百分比。
为了验证该检测方法的准确性，研究人员进行了一系列实验。他们将 Jurkat 细胞（一种 T 细胞系）和 MOLM 13 细胞（一种 AML 细胞系）进行系列稀释混合，然后对这些混合细胞的 DNA 进行 TCR 和白蛋白检测，并将检测结果与理论计算值进行比较。结果显示，Jurkat:MOLM13 稀释组的皮尔逊相关系数（r）达到 0.995（95% 置信区间 [CI]=0.9963 - 0.9999，p 值 < 0.0001）；MOLM13:Jurkat 稀释组的 r 值为 0.9965（95% CI = 0.9753 - 0.9995，p<0.0001） 。
此外，研究人员还对 8 名健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）以及这些供体的 T 细胞富集组分进行了检测。以流式细胞术检测的 T 细胞百分比作为 “金标准”，与 TCR 检测结果进行对比。结果表明，对于批量 PBMCs，r = 0.9938（95% CI = 0.9650 - 0.9989，p<0.0001）；对于富集的 T 细胞组分，r = 0.8610（95% CI = 0.3975 - 0.9744，p = 0.006） 。同时，研究人员通过标准定量实时 PCR（实时 qPCR）进行平行实验，进一步证实了所有实验中都存在很强的相关性。
最后，研究人员对接受 CAR-T 构建体 UCD19 治疗的临床试验受试者的外周血样本进行了分析。通过多重 dPCR，他们对 UCD19 CAR 进行定量检测，同时使用 TCR 检测来量化 T 细胞百分比，并利用白蛋白检测总核细胞。结果发现，TCR 计算的 T 细胞百分比与临床流式细胞术数据之间存在很强的相关性（r = 0.9486，95% CI = 0.7358 - 0.9909，p = 0.0003） ，并且在活细胞和总事件中相关性都较高；临床流式细胞术对 UCD19 的检测结果与实验多重检测之间也具有相关性（r = 0.9947，95% CI = 0.9696 - 0.9991，p<0.0001） 。此外，UCD19 CAR-T 检测的灵敏度和特异性也得到了验证。
讨论
研究人员成功开发并验证了一种 T 细胞特异性 dPCR 检测方法，该方法可与 CAR-T 和对照基因 dPCR 检测多重联用，在单一反应中实现对 CAR-T 细胞、T 细胞和有核细胞的定量。这一检测方法避免了通过流式细胞术对 T 细胞进行重复定量，并且结合超灵敏的 CAR-T dPCR 检测，能够在最小化样本需求的情况下，更深入地分析 CAR-T 细胞相对于 T 细胞的情况。
该检测方法基于 TCRα 基因（TRA，HGNC:12027）中的 TREC 位点，dPCR 扩增子仅存在于具有非重排 TCRα 的非 T 细胞中，进而可以计算出样本中 T 细胞相对于总核细胞的百分比。研究人员在健康供体和患者来源的 PBMC 样本中，均证实了基于流式细胞术和 dPCR 的 T 细胞定量之间存在很强的相关性，同时也验证了 CAR 和 T 细胞 dPCR 多重联用实验的可行性。
然而，该研究也存在一些局限性。例如，需要对细胞系中的拷贝数进行验证，因为细胞系在长期培养过程中可能会出现非整倍体；由于载体全序列的专利性质，在根据平均载体拷贝数（VCN）计算 CAR 细胞 /μL 时，无法校正非整合病毒拷贝数；在较高 T 细胞浓度的样本中，如 T 细胞富集的供体样本，相关系数通常较弱。不过，对于接受 CAR-T 细胞治疗的患者，尤其是经过淋巴细胞清除化疗后，外周血样本中 T 细胞占 80% - 100% 的情况并不常见。虽然 dPCR 基于 DNA，流式细胞术基于细胞，两者在活细胞和死细胞检测上可能存在固有差异，但在 UCD19 受试者中，对活细胞和总事件进行检测时，dPCR 定量与流式细胞术定量之间的相关性仍然很强。因此，TCR dPCR 检测在 CAR-T 患者的免疫监测中是一种有价值的替代流式细胞术的方法，随着在临床实验室中的应用，其在其他临床场景中的应用范围可能会进一步扩大。
材料和方法
- 检测方法设计：TCR 检测构建在染色体 14 上 TCRα/δ 位点（TRA，HGNC:12027）的 TCR 重排切除环（TREC）序列上，用于直接检测具有种系 TRA 的非 T 细胞。为了计算 T 细胞相对于总核细胞的百分比，该检测与对照基因白蛋白（ALB，HGNC:399）配对使用，计算公式为（[ALB 拷贝数 /μL - TCR 拷贝数 /μL]/ALB 拷贝数 /μL×100） 。为了展示与 CAR dPCR 检测的多重联用能力，TCR 和 ALB 检测与针对 UCD19 构建体的 CAR 检测进行了组合。TCR 和 UCD19 检测的引物由 Integrated DNA Technologies, Inc. 提供，定制的小沟结合剂（MGB）Taqman 探针购自 Thermo Fisher Scientific，ALB dPCR 检测试剂盒购自 Bio - Rad（检测 ID dHsaCNS381279675） 。
- 样本采集和处理：Jurkat 和 MOLM13 细胞系在含有 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中培养。进行系列稀释时，通过台盼蓝排斥法对活细胞进行计数，并按照特定比例混合 Jurkat 和 MOLM13 细胞。混合细胞离心后，使用 QIAmp DNA Mini 试剂盒（QIAGEN）提取 DNA，通过 Nanodrop 评估 DNA 的数量和纯度。
从科罗拉多儿童医院献血中心获取白细胞滤除浓缩物作为非管制医疗废物。使用淋巴细胞分离培养基（Corning）通过密度梯度离心法从 8 名健康供体中分离 PBMCs。其中一半的 PBMC 样本使用 EasySep Human T 细胞分离试剂盒（StemCell）进行 T 细胞富集。使用 Fortessa X - 20 对批量 PBMCs 或富集的 T 细胞组分进行流式细胞术检测（T 细胞群体定义为 CD3+，CD56?，CD4+或 CD8+），然后按照上述方法提取 DNA。
在 UCD19 CAR-T 细胞临床试验（NCT05535855）的临床相关时间点采集全血样本，并用于试验指定的相关性研究。经盖茨研究所生物样本库咨询委员会批准后，从 3 名受试者在 2 - 3 个时间点采集的 DNA 样本（共 8 个样本）用于 TCR、UCD19 和 ALB 检测的多重联用实验。样本使用遵循 IRB 二次使用协议编号 21 - 3730（2022 年 10 月 21 日批准）。dPCR 对 CAR 的定量结果根据产品的平均载体拷贝数（VCN）进行归一化处理，以计算 CAR 细胞 /μL 。
3. PCR 实验：基于纳米板的 dPCR 实验使用 Qiacuity 平台（QIAGEN）按照制造商的协议进行，退火温度设定为 55°C，每个样本使用 200 纳克 DNA 模板。除 UCD19 样本在 3 个独立实验中进行三次重复检测外，其他样本均在 4 个独立实验中进行两次重复检测。细胞系和 PBMC/T 细胞实验同时使用 FAM 和 VIC 标记的 TCR 探针以及 Cy5 标记的 ALB 探针。实时 qPCR 实验在 7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）上进行，使用 FAM 标记的 TCR 和 Cy5 标记的 ALB 探针，在 2 个独立实验中进行，每个样本进行三次重复检测。关于确定 CAR-T 特异性检测灵敏度和特异性的 PCR 实验的更多详细信息，请参考补充材料。
4. 统计分析：通过皮尔逊相关系数（r）来量化计算得到的 T 细胞百分比（细胞系稀释实验）或流式细胞术检测的 T 细胞百分比（PBMC 和 T 细胞组分、UCD19 受试者样本）之间的相关性。r 值也用于比较研究计算的 UCD19 CAR 基因定量结果与作为临床试验一部分进行的 UCD19 dPCR 定量结果。
数据可用性
原始数据可在向相应作者提出合理请求时提供。检测方法的详细信息列于表 1。
致谢
作者们感谢参与 UCD19 研究的患者。A.C.W. 获得了美国国立卫生研究院 / 国家儿童健康与人类发展研究所 1K08CA279762 - 01、摩根亚当斯基金会和游泳横渡美国组织的支持。M.E.K. 获得了美国国立卫生研究院 / 国家癌症研究所保罗?卡拉布雷西临床肿瘤学职业发展奖 K12CA086913 - 18、R01CA260909 和 R01CA269269，以及现代希望之轮基金会青年研究员奖、摩根亚当斯基金会、儿童癌症药物开发国际青年研究员奖（CureSearch Foundation）、塞巴斯蒂安坚强基金会、白血病与淋巴瘤协会和美国血液学会学者奖的支持。L.A.M. 获得了美国国立卫生研究院 Ruth L. Kirschstein 国家研究服务奖 T32CA236734 和游泳横渡美国组织的支持。T.J.F. 获得了美国国立转化科学推进中心科罗拉多临床与转化科学研究所（Colorado CTSI）UL1TR002535 资助以及美国国立癌症研究所 U01C232486 - 01 资助。
作者贡献
L.A.M.、T.J.F. 和 A.C.W. 构思了该研究。L.A.M.、T.J.F.、M.E.K. 和 J.E.S. 设计了 TCR 检测方法。L.A.M. 设计了 UCD19 检测方法。L.A.M.、L.S.、M.Y. 和 A.C.W. 进行了所有实验并分析数据。K.R.J. 和 A.O. 为 UCD19 受试者样本生成了流式细胞术和临床 dPCR 数据。A.C.W. 是本文的主要作者，所有作者都参与了本文的撰写和编辑工作。
利益声明
T.J.F. 披露受雇于 Sana Biotechnology, Inc.。
补充信息
补充信息包含两个 PDF 文档。Document S1 包含 Figures S1 - S6 和补充方法；Document S2 包含文章及补充信息。
