硫醚介导的蛋白质泛素化：构建基于亲和与活性的泛素化蛋白探针的关键技术

蛋白质泛素化（Protein ubiquitination）研究面临获取泛素化蛋白的难题。研究人员开展了化学泛素化方法的研究，利用 α - 溴代酮介导的连接策略，可生成单泛素化和多泛素化蛋白，有助于探究相关蛋白功能，意义重大。

　　蛋白质泛素化是真核细胞中一种关键的调节机制和翻译后修饰过程，涉及泛素（Ub）与靶蛋白之间异肽键的形成。尽管对蛋白质泛素化在各种细胞过程中所起的作用进行了广泛研究，但仍有许多问题有待解答。在对蛋白质泛素化及其相关通路和蛋白参与者进行生化和生物物理表征时，一个主要挑战在于生成单泛素化或多泛素化形式的泛素化蛋白。已有酶促和化学策略报道来应对这一挑战；然而，在以精确解读各种蛋白质特异性泛素化事件作用所需的数量和均一性来简便生成泛素化蛋白方面，仍存在未满足的需求。在本方案中，为泛素研究领域提供了一种由 α - 溴代酮介导的连接策略实现的化学泛素化方法。该方法可通过引入半胱氨酸取代目标赖氨酸（同时将天然半胱氨酸突变为丝氨酸），轻松生成感兴趣的单泛素化和多泛素化蛋白。以增殖细胞核抗原（PCNA）为例，详细介绍了生成含有可光激活交联剂的二聚和三聚泛素化 PCNA 的方案，该交联剂用于捕获潜在的阅读器蛋白。硫醚介导的蛋白质连接和纯化通常需要 2 - 3 周。泛素化策略的一个重要特点是能够在连接中引入迈克尔受体弹头，从而生成用于去泛素化酶（deubiquitinases）以及携带泛素的酶（如 HECT 和 RBR E3 泛素连接酶以及 E2 酶）的基于活性的探针。因此，该方法用途广泛，可轻松用于研究许多经历可逆泛素化的蛋白质的阅读器和擦除器。