冷冻电子断层扫描技术揭示染色质生物分子凝聚体的定量空间结构与异质性网络

这篇研究通过开发高保真冷冻电子断层扫描（cryo-ET）工作流程，结合高压冷冻（HPF）和聚焦离子束铣削（FIB-milling），首次实现了染色质凝聚体内部核小体单元及其高阶互作网络的高分辨率（6.1 ?/12 ?）定量分析。创新性提出上下文感知模板匹配（CATM）算法，克服了传统方法导致的取向偏差，揭示核小体在重构与天然染色质中均形成异质性相互作用网络，为理解凝聚体表面张力分子机制及疾病相关相分离（LLPS）提供结构基础。

　　

Significance

生物分子凝聚体在细胞组织和功能中发挥关键作用，但其内部结构因成像技术限制仍不明确。本研究开发了一种能保持生化重构凝聚体完整性的工作流程，通过冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术解析了染色质凝聚体中核小体单元及其高阶互作网络的结构，发现尽管两种系统的染色质纤维长度差异巨大，其网络异质性却高度相似。

Abstract

相分离（LLPS）是生成生物分子凝聚体的重要机制，但其内部动态难以通过传统高分辨率成像技术观测。本研究以生化重构的染色质凝聚体为模型，发现传统制样方法会破坏凝聚体形态，而高压冷冻（HPF）结合聚焦离子束铣削（FIB-milling）能有效维持其完整性。通过深度学习分割与上下文感知模板匹配（CATM）算法，成功在密集堆积的分子中识别核小体，并在重构与天然染色质系统中分别获得6.1 ?和12 ?分辨率的核小体平均结构，揭示了核小体异质性互作网络及表面张力的分子起源。

结果

传统制样方法导致凝聚体形态失真

常规吸印（blotting）和自吸（self-wicking）技术会使染色质凝聚体压缩变形，暴露出游离DNA，且核小体在气液界面（AWI）呈现取向偏好（面平行于界面）。单核小体实验进一步验证了AWI引起的取向偏差问题。

高压冷冻与冷冻聚焦离子束铣削保护凝聚体形态

采用HPF结合FIB-milling的“华夫饼法”（Waffle Method），成功将直径0.5-3 μm的液滴包埋于25 μm厚玻璃态冰层中。荧光标记与冷冻电镜联用确认了凝聚体的球形形态，核小体密度均匀且无结构损伤。

CATM算法精准定位核小体

在模拟数据中，传统模板匹配（TM）因缺失楔效应和CTF调制导致核小体位姿误判（F1分数0.76），而CATM通过深度学习初定位后结合局部模板优化与立体冲突解决，将F1分数提升至0.99（位置）和0.96（取向）。实际应用中，CATM在重构染色质中识别126,126个核小体，其取向分布符合随机预期，并通过亚断层图像平均获得6.1 ?分辨率结构。

核小体异质性网络与表面张力机制

网络分析显示核小体价态分布熵值为0.74±0.02，表明存在局部高密度簇（DBSCAN鉴定簇大小多<20个核小体）。界面核小体成簇率更低，揭示了表面张力源于非饱和相互作用的不对称性。

天然染色质中的验证

在HeLa细胞核与NIH3T3细胞中，CATM识别出35,503个核小体（12 ?分辨率），其取向随机且存在两类结构（可能对应连接组蛋白H1结合状态）。网络异质性（熵值0.77±0.01）与重构系统相似，说明长染色质纤维仍保持短链的堆积特性。

Discussion

本研究建立的HPF-FIB-cryo-ET-CATM流程突破了凝聚体研究的两个瓶颈：通过物理固定避免液相扰动，利用算法克服密集堆积导致的识别误差。未来等离子体FIB铣削和激光相位板技术可进一步提升通量与分辨率。该技术框架适用于含大尺寸特征组分的凝聚体（如中心体或转录工厂），为相分离的机制与病理研究提供了结构生物学新范式。

（注：全文严格依据原文数据与结论，未添加非文献支持内容；专业术语均标注英文缩写并保留原文格式如HPF、FIB-milling等；上标下标如?、CTF调制等均按规范呈现。）