无标记LLPS REDIFINE技术：多组分生物分子凝聚体的生物物理表征新方法

研究人员针对生物分子凝聚体（LLPS）研究中传统标记技术的局限性，开发了基于扩散核磁共振的无标记方法LLPS REDIFINE。该方法通过分析凝聚相与分散相的交换动力学，实现了对蛋白质、RNA及小分子在液液相分离体系中的扩散系数、分配比例、液滴尺寸及交换速率的同步测定，揭示了折叠RNA结合蛋白与无序蛋白形成凝聚体的动态差异，为理解生物凝聚体的功能机制提供了全新工具。成果发表于《Nature Communications》。

　　

论文解读
生物细胞内广泛存在的液液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS）现象，是形成无膜细胞器（如核仁、应激颗粒）的关键机制，与基因调控、病毒感染及神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症ALS）密切相关。然而，传统荧光标记技术可能干扰蛋白质构象，且难以同步分析多组分凝聚体的动态特性。如何无创、精准地表征生物分子凝聚体的物理性质，成为领域内亟待突破的瓶颈。

针对这一挑战，瑞士苏黎世联邦理工学院的研究团队开发了名为LLPS REDIFINE（REstricted DIFusion of INvisible speciEs）的创新方法。该技术通过扩散核磁共振（NMR）捕捉分子在凝聚相与分散相之间的交换动力学，无需标记即可测定扩散系数（D_dil/D_cond）、分配比例（ν_cond）、液滴平均半径（R_drop）及界面渗透率（p），相关成果发表于《Nature Communications》。

关键技术方法
研究采用脉冲梯度自旋回波（PGSE）NMR技术，通过变梯度强度与扩散时间（Δ）的多维实验获取衰减曲线；结合滤过交换光谱（FEXSY）验证交换速率；利用荧光恢复漂白（FRAP）和显微镜成像进行交叉验证。样本包括FUS NTD（N端结构域）、全长FUS、DDX4、SARS-CoV-2核衣壳蛋白（Nu）与RNA复合物等，通过琼脂糖水凝胶稳定液滴。

研究结果
REDIFINE揭示双相蛋白LLPS系统的扩散常数与液滴参数
以FUS NTD为模型，通过全局拟合扩散衰减曲线，测得凝聚相扩散系数（8.9×10^?13 m²/s）比分散相低两个数量级，液滴半径1.2 μm，交换速率k_cd=1 s^?1。FRAP实验验证了液滴动态性，但标记蛋白易引发聚集，凸显无标记优势。

LLPS REDIFINE应用于全长FUS与水分子
全长FUS（90%位于凝聚相）的液滴中检测到3%的结构化水，扩散速度比自由水慢10²-10³倍，证实凝聚相的高密度特性。

FEXSY独立验证交换速率
DDX4的REDIFINE与FEXSY数据一致（k_ex=0.61 s^?1），且老化FUS样本的交换速率显著降低，表明方法可靠性。

双分子RBP-RNA凝聚体的特性
Nu蛋白与s2m RNA形成的凝聚体交换速率更快（4.8 s^?1），液滴更小（0.8 μm）；而PTBP1:3xUCUCU复合物在低温下交换速率降至30 s^?1，揭示RNA结合特异性影响动态性。

蛋白结构与凝聚体性质的相关性
无序蛋白（如FUS、DDX4）形成大液滴（R_drop~1 μm）且交换慢，而含折叠结构域的蛋白（如Nu、PTBP1）与RNA结合后液滴更小、更动态，其交换速率与二级结构预测因子（SSP）和净电荷（Z）比值呈正相关。

结论与意义
LLPS REDIFINE首次实现了多组分生物凝聚体的无标记、全参数表征，突破传统技术对标记依赖和单组分分析的局限。研究发现：1）无序蛋白通过多价相互作用形成稳定大液滴；2）RNA的加入显著提升凝聚体动态性；3）结构化水存在于液滴内部。该技术可扩展至离子、药物-蛋白互作研究，为理解LLPS在疾病（如ALS、COVID-19）中的作用提供新视角。未来或通过扩散峰度成像（DKI）实现细胞内凝聚体的空间解析，推动病理机制研究和药物筛选。