基于RdRp基因保守区设计的正番茄斑萎病毒通用检测技术及蓟马载体监测新策略

为解决正番茄斑萎病毒(Orthotospovirus)检测引物覆盖不全和蓟马(Thrips)DNA条形码引物不匹配的问题，研究人员开发了靶向RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因的通用RT-PCR检测技术，并设计了适用于Terebrantia亚目蓟马的COX1基因条形码引物。该研究通过生物信息学分析322条病毒序列和190条昆虫序列，建立可识别所有已知正番茄斑萎病毒变种的引物组合，同时开发基于延伸因子1-α(EF1a)的RNA内参系统。成果为植物病毒监测和生物安全防控提供了高效工具。

　　

在全球农业生产中，正番茄斑萎病毒(Orthotospovirus)及其传播媒介蓟马(Thrips)构成重大生物威胁。这类病毒通过蓟马以持久增殖方式传播，仅幼虫期可获毒但终身带毒，导致番茄、花生等经济作物严重减产。随着高通量测序技术发展，正番茄斑萎病毒种类已增至26种，但现有检测引物无法覆盖新发现毒株的遗传变异。更棘手的是，国际通用的COX1基因条形码引物LCO1490/HCO2198因设计年代久远，与当代蓟马序列存在大量错配，严重影响监测准确性。

针对这些技术瓶颈，澳大利亚昆士兰大学的研究团队在《Phytopathology Research》发表重要成果。研究通过多序列比对发现，正番茄斑萎病毒的RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因存在精氨酸(AGR)和丝氨酸(TCN)的绝对密码子偏好性，这种在布尼亚病毒目(Bunyaviricetes)中独特的进化特征，为设计泛特异性引物提供了分子基础。团队同时创新性地将EF1a基因内含子差异转化为RNA质量内参，并重构了蓟马COX1基因的条形码引物体系。

研究采用生物信息学驱动的实验验证策略：首先通过MAFFT比对322条病毒RdRp序列和928条昆虫EF1a序列，筛选出7-9个密码子的保守滑动窗口；利用IQ-TREE构建最大似然系统发育树揭示病毒进化关系；采用合成核酸模板（含最弱杂交位点）验证检测灵敏度；最后通过纳米孔测序评估引物在模拟群落中的定量偏差。

RdRp通用检测技术突破
研究鉴定出6种引物结合模式组合(F1R1-F3R3)，其中F3R3仅见于Lisianthus坏死环斑病毒(LNRV)。通过多重引物策略，新体系可检测低至10^-8 fmol的DNA模板，灵敏度比常规方法提升100倍。在测试的19个植物样本中，成功检出番茄斑萎病毒(TSWV)、西瓜银斑病毒(WSMoV)等8种病毒，扩增片段稳定在250bp。

EF1a内参系统创新
设计的引物在256种昆虫中显示广泛兼容性，其中59种可通过内含子差异区分gDNA与mRNA。在西方花蓟马(F. occidentalis)等4种媒介中，gDNA扩增产物(700bp)比cDNA(600bp)长100bp，为RNA提取质量提供直观判据。

COX1条形码优化
新设计的6对引物中，Trb-F1/R2在模拟群落测试中表现最优，其读长比例与蓟马干重相关性达0.99。相比传统引物对C1-J-1751/C1-N-2191（漏检T. eucharii），新体系全面覆盖Terebrantia亚目所有已知媒介物种。

这项研究的意义在于：①首次利用病毒密码子偏好性开发检测工具，为其他RNA病毒检测提供范式；②建立的"病毒-载体"协同监测策略，可应用于边境检疫和田间预警；③COX1引物设计方法解决了节肢动物DNA条形码领域长期存在的引物错配问题。特别值得注意的是，该团队开发的Python脚本已公开共享，为保守序列分析提供了标准化流程。这些成果将显著提升对正番茄斑萎病毒传播链的监控能力，为全球粮食安全提供技术保障。