基于重组酶聚合酶扩增(RPA)和环介导等温扩增(LAMP)的入侵性草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)快速高敏检测新方法

针对入侵性害虫草地贪夜蛾(FAW)形态鉴定困难、传统PCR检测耗时昂贵的问题，印度农业昆虫资源国家局团队开发了基于信号肽基因特异性靶点的RPA和LAMP等温扩增检测法。RPA assay在39°C下30分钟即可通过颜色变化实现100 fg/μL超高灵敏度检测，无需复杂设备，为田间实时监测提供革命性工具。

　　

论文解读
背景与挑战
草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)作为全球最具破坏性的入侵性鳞翅目害虫，已对72科353种作物造成威胁，尤其导致亚洲和非洲玉米减产高达34%。其早期幼虫与近缘种（如斜纹夜蛾、棉铃虫）形态高度相似，传统鉴定依赖雄性生殖器解剖或耗时3小时的PCR检测，严重制约田间防控时效。现有LAMP技术虽简化操作，但需60°C高温设备，难以在资源匮乏地区推广。

研究设计与方法
印度农业研究委员会-国家农业昆虫资源局团队通过全基因组in silico（计算机模拟）分析，首次锁定草地贪夜蛾12号染色体上LOC118262236基因中一段编码信号肽（指导蛋白质跨膜运输的短肽序列）的特异序列，据此设计PCR、LAMP（需6对引物）和RPA（仅需2对引物）检测体系。采用50份印度多地采集的草地贪夜蛾样本及7种鳞翅目近缘种为对照，通过以下关键技术验证：

1. 特异性验证：梯度PCR（52°C）、LAMP（60°C）和RPA（39°C）分别结合电泳或羟萘酚蓝(HNB)/SYBR Green I染料显色；
2. 灵敏度测试：系列稀释DNA样本（100 ng-10 fg/μL）；
3. 田间验证：跨地理区域样本检测。

核心发现

1. 特异性验证

• PCR：仅草地贪夜蛾产生550 bp条带，棉铃虫和蔗螟出现非特异条带；
• LAMP：阳性样本遇HNB染料变天蓝色（镁离子消耗），阴性保持紫色；
• RPA：SYBR Green I染料使阳性样本紫外下显亮绿色，阴性为砖红色。

1. 灵敏度突破

• PCR最低检测限1 pg/μL，而LAMP与RPA均达100 fg/μL（灵敏度提升10倍）；
• RPA在39°C室温条件30分钟完成检测，无需加热设备。

1. 田间适用性

• RPA对50份田间样本检出率100%，且与实验室结果完全一致；
• 操作人员无需专业培训，仅需UV透射仪观察颜色变化。

意义与展望
该研究首创的RPA检测技术解决了传统分子诊断在成本、设备依赖性和时效性上的三大瓶颈：

1. 技术革新：首次将RPA应用于鳞翅目害虫检测，其室温操作特性颠覆了现有等温扩增技术依赖加热模块的局限；
2. 防控价值：为发展中国家小农户提供"口袋实验室"级解决方案，助力FAW早期预警；
3. 推广潜力：该信号肽靶点设计策略可拓展至其他入侵物种检测体系。

研究团队指出，未来可进一步开发RPA试纸条实现裸眼判读，并探索其在昆虫抗药性监测中的应用。这项发表于《Scientific Reports》的成果，标志着田间分子诊断技术向"无设备化"迈出关键一步。