离子淌度质谱技术筛查人血清蛋白羰基化修饰位点：揭示类风湿关节炎与氧化应激的分子关联

本研究针对氧化应激相关疾病中蛋白羰基化修饰（PTMs）检测难题，开发了基于离子淌度质谱（IMS-MS/MS）的DDA/DIA双模式分析策略。通过醛反应探针（ARP）标记结合亲和富集技术，在39例类风湿关节炎（RA）和29例健康人血清中鉴定出86种羰基化肽段，发现人血清白蛋白（HSA）的Cys58、Lys223等热点修饰位点，揭示了基础性羰基化修饰特征。该研究为氧化损伤标志物筛查提供了高灵敏度方法学框架。

　　

氧化应激是多种疾病的共同病理基础，其中蛋白质羰基化作为不可逆的氧化损伤标志，与阿尔茨海默病、糖尿病和类风湿关节炎（RA）等慢性炎症疾病密切相关。然而，这类修饰具有结构多样性、丰度低、检测难度大等特点，传统技术难以实现精准定位和定量。更棘手的是，现有RA诊断标志物如类风湿因子（RF）和抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）灵敏度不足，亟需发现新的分子标记物。

为解决这一难题，来自莱比锡大学的研究团队在《Journal of Proteome Research》发表创新性研究。他们建立了一套整合离子淌度分离（IMS）与质谱检测的先进工作流程：首先用醛反应探针（ARP）特异性标记血清蛋白中的羰基，经胰酶消化后通过亲和层析富集，最终采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）耦合电喷雾电离-离子淌度-串联质谱（ESI-IMS-MS/MS）进行分析。研究创新性地结合数据依赖性采集（DDA）构建光谱库与数据非依赖性采集（DIA）定量分析策略，并利用Skyline软件进行多维度数据验证。

ARP-肽段光谱库构建
通过DDA模式分析发现899个ARP标记肽段，经严格筛选后确认86个真实羰基化肽段，其中72个位于人血清白蛋白（HSA）。质谱碎片离子分析揭示28个金属催化氧化（MCO）位点主要分布在金属结合位点附近，如Cys58周边区域。值得注意的是，Lys223位点检测到11种不同类型的羰基化修饰，包括乙二醛加合物（+371.126 Da）和丙二醛希夫碱（+367.131 Da）等。

新修饰类型的发现
通过碎片离子谱相似性比对和从头测序（de novo sequencing），发现6种未报道的修饰类型，如质量偏移+395.138 Da的未知修饰（推测组成为C₃H₂N₂O）。这些修饰在HSA的Lys214、Lys219等位点反复出现，提示可能存在新的反应性羰基物种（RCS）加合途径。

临床样本定量分析
在68例血清样本中，93.8%的羰基化肽段信噪比>3，批次内重复性CV<20%。尽管RA患者与健康人组的修饰水平无显著差异，但发现HSA的Cys58、Lys549等位点修饰与既往体外实验高度一致，证实这些位点是体内氧化防御的关键靶点。

该研究的重要意义在于：首次系统绘制了人血清蛋白羰基化修饰图谱，建立的方法可同时捕获MCO、AGEs（晚期糖基化终产物）和ALEs（高级脂质氧化终产物）等多途径修饰；发现HSA的特定结构域（如Sudlow结合位点I）具有羰基"热点"特征，为理解蛋白质抗氧化机制提供新视角；开发的IMS-DIA策略将检测灵敏度提升至fmol级别，为疾病生物标志物筛查树立了新标准。尽管当前未发现RA特异性修饰模式，但技术框架可扩展至其他氧化应激相关疾病研究，特别是对低丰度修饰蛋白的分析将成未来重点方向。

研究也存在一定局限：主要捕获高丰度血清蛋白修饰，中等丰度蛋白信号可能被掩盖；部分修饰因衍生化后仍存在同分异构现象而难以区分。作者建议后续可采用链霉亲和素替代avidin以减少非特异性背景，或结合外泌体分选技术拓展低丰度蛋白检测维度。这些发现为氧化应激相关疾病的分子机制研究和临床诊断策略开发奠定了重要基础。