红细胞胆固醇含量直接检测方法的开发与验证：一种评估动脉粥样硬化性心血管疾病残余风险的新策略

本研究针对传统红细胞膜胆固醇(CEM)检测方法繁琐、临床适用性差的问题，开发了一种基于SDS和NaNO2双重变性处理的直接酶法检测技术。该方法成功消除血红蛋白干扰，实现红细胞胆固醇含量（154.8±2.9 mg/dL男性/155.9±6.9 mg/dL女性）的精准测定，揭示其与动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)严重程度独立相关，为残余风险评估提供了新型独立生物标志物。

　　

动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）已成为全球健康的主要威胁，尽管低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）控制策略显著降低了发病率，但临床上仍存在大量接受规范治疗后仍发生心血管事件的"残余风险"患者。这种困境促使科学家寻找超越传统血脂指标的新型生物标志物。红细胞作为血液中数量最丰富的细胞，其膜胆固醇含量（CEM）与ASCVD严重程度呈正相关，且独立于LDL-C水平，这使其成为极具潜力的风险评估指标。然而，现有CEM检测需要复杂的膜分离和脂质提取步骤，严重阻碍了临床转化。

东京医科齿科大学（现东京科学研究所）的Az.Y.团队在《Bioscience Reports》发表的研究中，创新性地开发了红细胞总胆固醇的直接酶法检测技术。研究人员采用SDS和NaNO₂双重变性处理消除血红蛋白干扰，通过同步测定555nm血红蛋白吸光度校正红细胞回收率，建立了可同时测定体积浓度（mg/dL）和单细胞含量（fg/cell）的分析体系。研究纳入17名健康志愿者，采用密度梯度离心分离不同成熟阶段红细胞，结合Abell-Kendall金标准法进行方法学验证。

关键技术包括：1）血红蛋白干扰消除技术（1% SDS+10mM NaNO₂）；2）双波长（555/600nm）同步检测系统；3）密度梯度红细胞分馏技术；4）基于MCHC的回收率校正算法。方法验证显示日内精密度CV≤4.1%、日间精密度CV≤3.8%，加标回收率达96.5-98.9%。

【验证血红蛋白干扰消除】通过比较血清样本添加血红蛋白前后的测定差异，证实双重变性处理可使测定值恢复至98.1±3.8%（图1A），吸收差谱分析显示该方法有效消除血红蛋白的光谱干扰（图1B）。与Abell-Kendall法相比，新方法测定结果无显著差异（125.0±5.3 vs 127.1±4.5 mg/dL）（图1C）。

【健康人群基准值建立】在12名健康受试者中，男性红细胞胆固醇含量为154.8±2.9 mg/dL（139.0±5.2 fg/cell），女性为155.9±6.9 mg/dL（140.8±5.3 fg/cell）（图3A,B）。值得注意的是，体积浓度与CEM显著相关（r=0.598），但与血清TC、LDL-C等脂质参数无相关性（图3E-H），提示其作为独立生物标志物的潜力。

【红细胞衰老与胆固醇动态】密度梯度分析显示，最下层（最老化）红细胞的胆固醇含量较上层（最年轻）显著降低（第七层体积浓度降低P=0.037，第十层单细胞含量降低P=0.016）（图4A,B）。该现象与网织红细胞比例（图4C）和HbA1c水平（图4D）的梯度变化一致，证实衰老红细胞存在胆固醇丢失现象。

这项研究突破了传统CEM检测的技术瓶颈，首次实现无需膜分离的红细胞胆固醇直接定量。特别重要的是，发现红细胞胆固醇含量与细胞衰老程度呈负相关，这为理解ASCVD病理机制提供了新视角——衰老红细胞胆固醇减少可能导致膜刚性增加，促进微循环障碍。该方法操作简便（仅需20分钟孵育）、成本低廉，有望成为临床评估ASCVD残余风险的常规检测手段。未来研究需在患者群体中验证其预测价值，并探索胆固醇外流机制与动脉粥样硬化发展的因果关系。